拟穴青蟹（Scylla paramamosain）肌浆蛋白过敏原的致敏性研究

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1、学校编码10390分类号S986学号201514908005密级博士学位论文拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）肌浆蛋白过敏原的致敏性研究指导教师：苏文金教授刘光明教授作者姓名：杨阳申请学位级别：博士学科专业：水产研究方向：水产品加工论文提交日期：2018年05月03日论文答辩日期：2018年06月02日学位授予单位：集美大学学位授予日期：2018年06月答辩委员会主席：陈清西教授博士学位论文拟穴青蟹（Scyllaparamamosain）肌浆蛋白过敏原的致敏性研究ResearchontheAllergenicityofMy

2、osinogenAllergensfromMudCrab(Scyllaparamamosain)学科门类：农学作者姓名：杨阳指导教师：苏文金教授刘光明教授学科专业：水产研究方向：水产品加工学位授予单位：集美大学论文答辩日期：2018年06月02日学术诚信声明兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。声明人(签名)：时间：保护知识产权声明本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文

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4、对拟穴青蟹引起的食物过敏反应流行病学调查和拟穴青蟹过敏原结构、表位及其致敏性的系统分析是开发低致敏食品和甲壳类水产食物过敏性疾病控制的基础。本研究于2010年至2017年对集美大学在校生发放食物过敏流行病学调查问卷共17324份，对收回的13361份有效问卷统计结果显示，蟹类是该群体中主要的过敏食物，进一步对调查对象中14164名学生的血清学分析表明蟹类过敏比例为4.31%，而拟穴青蟹的肌浆蛋白能够被65.14%的蟹类过敏患者血清中的特异性免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E识别。精氨酸激酶（argininekinase，

5、AK）是拟穴青蟹肌浆蛋白中的主要过敏原，本文首先通过X射线衍射获得了分辨率为3.0Å的AK晶体结构，基于蛋白质结构的对比分析结果表明，节肢动物中的AK具有保守的一级结构、二级结构和高级结构。基于抗原表位的对比分析结果表明，不同物种中AK线性表位区域呈现高度的一致性，主要分布于氨基酸序列（aminoacid，AA）25−44、AA130−155和AA308−321；而构象表位则主要分布于AK高级结构保守区。此外，本研究完成了对拟穴青蟹肌浆蛋白中新型过敏原磷酸丙糖异构酶（triosephosphateisomerase，TIM）和肌质钙结合

6、蛋白（sarcoplasmiccalcium-bindingprotein，SCP）的分离纯化，并首次发现细丝蛋白C（filaminC，FLNc）是存在于拟穴青蟹肌浆中的新型过敏原。对拟穴青蟹肌浆中四种过敏原的血清学分析结果表明，AK和FLNc能被较多的蟹类过敏患者血清识别，而识别TIM和SCP的患者血清数量较少。目前这四种过敏原已被世界卫生组织/国际免疫学会联盟（worldhealthorganization/internationalunionofimmunologicalsocieties，WHO/IUIS）的过敏原命名系统收录，

7、AK、SCP、TIM和FLNc分别被命名为Scyp2、Scyp4、Scyp8、和Scyp9。采用蟹类过敏患者特异性识别的过敏原对过敏患者进行嗜碱性粒细胞激活试验（basophilactivationtest，BAT），以进一步确定患者的过敏反应，结果发现嗜碱性粒细胞表面抗原CD63和CD203c的表达上调与患者自诉的过敏症状严重程度呈现正相关。以经过BAT验证的过敏患者血清IgE为靶蛋白，对噬菌体展示肽库进行亲和淘选，结合生物信息学分析鉴定了AK的5个线性表位区域和8个构象表位区域、TIM的4个线性表位区域和2个构象表位区域、FLNc的

8、6个线性表位区域和6个构象表位区域、SCP的6个构象I表位区域。利用Balb/c小鼠建立的四种肌浆蛋白过敏原的动物模型表明，AK在机体内的致敏性最强，能够引起B淋巴细胞的增殖，同时产生高水平的抗原特异性Ig