拟穴青蟹SpCrus2的免疫功能研究.pdf

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1、学校代码：10264研究生学号：M150110172上海海洋大学硕士学位论文拟穴青蟹SpCrus2的免疫题目：功能研究Immunefunctionalanalysesof英文题目：SpCrus2inthemudcrab,Scyllaparamamosain专业：生物学研究方向：甲壳动物先天免疫姓名：王慧指导教师：李新苍二O一八年四月三日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的

2、内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注徐田军上海海洋大学教授主席房文红东海水产研究所研究员委员么宗利东海水产研究所副研究员委员周俊芳东海水产研究所副研究员委员王元东海水产研究所助理研究员秘书答辩地点东海水产研究所答辩日期2018.5.20上海海洋大学硕士学位论文拟穴青蟹SpCrus2的免疫功能研究摘要拟穴青蟹(ScyllaParamamosain)简称青蟹，属于梭子蟹科（Portunidae），具有较高的营养价值、药用价值和经济价值

3、，是我国重要的海水养殖蟹类。当前，细菌、病毒和寄生虫等感染对拟穴青蟹的养殖业造成了巨大的损失，如何通过提高拟穴青蟹自身的免疫力来抵抗日益严重的病害已成为目前蟹类养殖业中一个亟待解决的问题。抗菌肽是一类生物体中普遍存在并具有广谱抗微生物活性的小分子多肽，已证实是天然免疫系统的重要组成部分，而crustins又是甲壳动物抗菌肽中比较重要的一种类型。对先天免疫相关基因的研究，不仅有助于弄清楚甲壳动物抗菌以及抗病毒的免疫机理，为蟹类病害的预防以及控制提供理论依据和技术支持，也有助于进一步完善无脊椎动物先天免疫理论。甲壳肽SpCrus2抗菌活性及机制研究。本研究从拟穴青蟹中鉴定获得SpCrus2，通过生

4、物信息学分析后发现它的cDNA序列共620bp，其中开放阅读框495bp，编码164个氨基酸。预测的蛋白质结构为：一个17个氨基酸的信号肽，一个甘氨酸富集疏水区（GRR），一个包含乳清酸性蛋白结构域的半胱氨酸富集区（CRR）。SpCrus2与对虾中大多数的II型crustins（IIa和IIb）有很高的相似性，但却有一种新型的半胱氨酸残基分布模式，这与大多数crustins截然不同。SpCrus2与通信鳌虾PlCrus3有高度的相似性和相同的半胱氨酸残基分布模式，本研究将它们归为IIc型crustins。组织分布和表达模式研究结果表明，SpCrus2主要分布在鳃组织，并且在副溶血弧菌和金黄色葡

5、萄球菌的刺激后上调表达，表明该基因可能参与了抗弧菌免疫。为了进一步探究这种新型crustin的功能并揭示两种新型半胱氨酸分布模式是否有功能的差异，我们将SpCrus2CRR的两个氨基酸（V106突变为C，C151突变为F）突变后得到SpCrus2CRR的突变体，即CRR-M，使其与对虾经典crustins的半胱氨酸残基分布模式相似，随后将SpCrus2、GRR、CRR和CRR-M分别过表达和纯化，然后开展一系列的功能验证实验：包括抑菌实验、微生物结合实验、微生物多糖结合实验及凝集实验。综合抑菌实验和微生物结合实验结果可知，SpCrus2及其两个功能结构域GRR和CRR对这些微生物具有广泛但不同

6、强度的抑菌和结合活性，且CRR比CRR-M有更强的结合活性。微生物多糖结合实验的结果表明，SpCrus2对LPS、LTA和β-葡聚糖有很强的结合活性，并表现出一定的浓度依赖性，而结合PGN的活性较弱，而且根据实验结果我们可以推测SpCrus2对上海海洋大学硕士学位论文细菌的结合活性可能主要是GRR作用的结果，而整个蛋白对真菌的结合活性需要GRR和CRR协同发挥作用。凝集实验结果表明，SpCrus2在Ca2+的作用下可促使革兰氏阳性菌的凝集。综上所述，SpCrus2对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及真菌都有一定程度的抗菌活性。其中SpCrus2的甘氨酸富集区结构域，即GRR，表现出了显著的抗革兰氏阴

7、性菌和真菌的抗性，而CRR有着很强的抗革兰氏阳性菌的抗性。GRR和CRR相对于整个SpCrus2蛋白来说抗菌活性较弱，这表明GRR和CRR协同发挥它们潜在的抗菌功能。此外，CRR-M相对于CRR抗菌活性较弱，这表明包含新型半胱氨酸分布模式的SpCrus2可能比大多数经典半胱氨酸分布模式的II型crustins抗菌活性强。我们推测SpCrus2的抗菌能力可能是由其与细菌的多糖结合和凝集活性产生的。S