资源描述：
《改性聚乙烯亚胺及其叶酸修饰的反义寡核苷酸传递系统的研究.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、改性聚乙烯亚胺及其叶酸修饰的反义寡核苷酸传递系统的研究在肿瘤治疗领域中,反义寡核苷酸(Antisenseoligonucleotide,AS-ODN)类药物及相关治疗技术越来越得到大家的重视。目前虽然已有AS-ODN类药物进入临床阶段,但仍存在稳定性差、跨膜能力弱、易被核酸酶降解等问题。LOR-2501是一种含有20个碱基的AS-ODN,因为能够与核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotidereductase,RNR)大亚基R1的mRNA编码区互补,具有一定的抗肿瘤活性。目前大量的研究集中于AS-ODN类药物载体的开发和应用领域。聚乙烯亚胺(Pol
2、yethyleneimine,PEI)与其他阳离子聚合物相比,有着独特的“质子海绵效应”,PEI装载药物后能够通过大量的氨基吸收质子,导致溶酶体渗透性肿胀,破裂后将药物释放到细胞质中。PEI作为AS-ODN载体时,高分子量的PEI(25kDa)转染效率相对较高但是毒性较大,而低分子量的PEI(800Da)毒性较小但转染效率也相对较低,因此如何通过PEI的改性和靶向配体修饰等研究方法在提高PEI转染效率的同时减少其毒性成为了研究热点。本论文研究内容主要包括以下几部分:1.PEI-SS-OA的合成及载药系统的建立本文首先在PEI的基础上,合成了一种含有二
3、硫键(S-S)的聚合物,使用油胺(Oleylamine,OA)对其进行了疏水性修饰(命名为PEI-SS-OA)。同时采用乙醇注入法制备了PEI-SS-OA载药系统。制备的PEI-SS-OA载药系统具有一定的缓冲容量,进入细胞后能够有效地释放自身携带的药物。在最优制备条件下的粒径为201.0±5.9nm,zeta电位值为43.5±0.9mV。PEI-SS-OA对HeLa和A549细胞无明显毒性,细胞活力均在90%以上。在30天内,PEI-SS-OA载药系统的粒径略有增加,zeta电位值无明显变化。2.PEI-SS-OA/LOR-2501传递系统的建立和
4、评价为了对制备的PEI-SS-OA载体的转染效率进行评价,本文选择了一种AS-ODN类药物LOR-2501,建立了PEI-SS-OA/LOR-2501传递系统。首先以粒径和zeta电位为指标,得到了最佳的氮磷比(N/P)为8:1。此时,PEI-SS-OA与LOR-2501已完全结合,还原剂的加入能够促使LOR-2501的释放。体外细胞评价实验中,MTT抗肿瘤实验和流式细胞计数法测定转染效率实验结果表明制备的PEI-SS-OA载体能够将LOR-2501转染进入到HeLa和A549细胞中,抑制肿瘤细胞的生长。采用激光共聚焦显微镜观察到PEI-SS-OA/
5、LOR-2501复合物能够大量地进入到肿瘤细胞。实时荧光定量PCR测定R1mRNA结果显示,复合物在HeLa和A549细胞中对R1mRNA的下调效率分别为40.8%和43.6%,与PEI相比分别提高了17.8%和23.3%。Western-blot测定R1蛋白结果显示,PEI-SS-OA组的R1蛋白下调效率明显高于PEI组。3.PEI-NH-OA的合成及载药系统的建立本文同时在PEI的基础上,合成了一种含有酰胺键(N-H)的聚合物,使用油酰(Oleoacyl,OA)对其进行了疏水性修饰(命名为PEI-NH-OA)。采用乙醇注入法制备了PEI-NH-O
6、A载药系统。PEI-NH-OA同样具有一定的缓冲容量。在最优制备条件下的粒径为102.0±3.9nm,zeta电位值为54.5±3.1mV。PEI-NH-OA与PEI本身相比毒性明显减小,HeLa和A549细胞活力均在90%以上。在30天内,PEI-NH-OA载药系统粒径和zeta电位均无明显变化。与PEI-SS-OA载药系统相比,PEI-NH-OA载药系统粒径更小,阳离子特性更强,具有更好的稳定性。4.PEI-NH-OA/LOR-2501传递系统的建立和评价本文同时建立了PEI-NH-OA/LOR-2501传递系统,对PEI-NH-OA的转染效率进
7、行了评价。以粒径和zeta电位为指标,得到了最佳的N/P为6:1。此时,PEI-NH-OA与LOR-2501已完全结合,形成纳米复合物。抗肿瘤实验显示复合物对HeLa和A549细胞的抑制率分别为46.2%和41.5%。通过流式细胞计数和激光共聚焦显微镜观察发现,复合物能够大量地进入到HeLa和A549肿瘤细胞内。实时荧光定量PCR测定R1mRNA结果显示,PEI-NH-OA作为载体时,在HeLa和A549细胞中对R1mRNA的下调效率分别为37.7%和34.5%,而PEI组仅为20%左右。Western-blot测定R1蛋白结果显示,R1蛋白的下调率
8、分别为50.1%和46.3%。可见PEI-NH-OA能够高效地将LOR-2501转染进入细胞,与PEI-SS
