改性穿膜肽的合成及其寡核苷酸纳米给药系统的研究

《改性穿膜肽的合成及其寡核苷酸纳米给药系统的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、改性穿膜肽的合成及其寡核苷酸纳米给药系统的研究Studyonthemodifiedcell-penetratingpeptideanditsnanoparticlessystemforoligonucleotidedelivery作者姓名：杨东生专业名称：生物化学与分子生物学研究方向：基因工程指导教师：刘松财教授学位类别：理学博士培养单位：动物科学学院论文答辩日期：2018年06月04日授予学位日期：年月日答辩委员会组成：姓名职称工作单位主席张永亮教授华南农业大学委员曾林研究员军事科学院陈振文教授首都

2、医科大学张嘉保教授吉林大学赵志辉教授吉林大学滕利荣教授吉林大学任文陟教授吉林大学中文摘要近年来，随着人们生活节奏加快、环境污染、饮食结构变化，肿瘤疾病的发病率在逐年增加。因此，治疗肿瘤的药物研发具有重要意义。在肿瘤治疗领域中，寡核苷酸类药物（Antisenseoligonucleotide,AS-ODN）类药物及相关治疗技术进入了大家的视野并得到极大重视。寡核苷酸是一类重要的特异性基因表达物质，包括小干扰RNA和反义寡核甘酸等，目前由于存在着稳定性差、较高负电荷、跨膜能力弱、易被核酸酶降解等问题，限制

3、了研究发展。LOR-2501是一种含有20个碱基的AS-ODN，因为能够与核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotidereductase,RNR）大亚基R1的mRNA编码区互补，具有一定的抗肿瘤活性。靶向survivin基因的2´-甲氧基修饰的siRNA可以有效抑制survivin蛋白的表达，从而抑制了肿瘤细胞的增殖。本文针对寡核苷酸存在的问题，首先合成了一种新型的阳离子材料-硬脂酸修饰的八聚精氨酸（Sta-R8），该材料既保留了八聚精氨酸的细胞穿透性，修饰后又具有两亲性可自包封形成纳米载体，进一步

4、提高其稳定性及转染特性；然后以Sta-R8作为基质材料制备阳离子脂质体传递系统（SLP），制备得到的脂质体与游离穿膜肽相比，毒性减小，稳定性好；并且采用SLP装载反义寡核苷酸及小干扰核糖核酸（siRNA），结果显示作为这两种载药系统均能够高效的传递核苷酸进入肿瘤细胞；最后为了提高SLP的靶向性，本文制备了具有肿瘤特异性靶向配体-转铁蛋白（Tf）修饰的Tf-SLP并装载siRNA，结果显示Tf-SLP能有效传递靶向Survivin基因的siRNA进入肿瘤细胞，并且对Tf高表达的肿瘤细胞具有靶向作用。本论

5、文研究的具体内容概括如下：1.StA-R8的合成及传递系统的建立本文首先在R8的基础上，合成改性穿膜肽StA-R8。采用乙醇注入法制备了StA-R8脂质体传递系统（SLP）。对SLP传递系统的制备工艺进行优化并对其稳定性进行考察。制备的最优条件是选择HEPES(pH=7.4)，StA-R8、胆固醇、蛋黄卵磷脂的摩尔比在20/35/45时制备得到的脂质体粒径为126.4±6.2nm，zeta电I位值为18.3±1.3mV。StA-R8对HeLa和A549细胞细胞毒性较低，SLP的细胞毒性更低，细胞活力均

6、在80%以上。在25天内，SLP传递系统的粒径略微增加，但变化不大，而zeta电位值无明显变化。2.StA-R8脂质体/LOR传递系统的建立和评价为评价制备的SLP载体系统的转染效率，本文选择LOR进行装载和递送，LOR是一种AS-ODN类药物，具有抗肿瘤活性。首先以粒径和zeta电位作为考察指标，结果显示，脂质体当N/P达到6以后，SLP与LOR形成的纳米粒子粒径基本无明显变化，电位数值在N/P比变化的过程中呈现由负到正的趋势，说明了随着阳离子脂质体量的增加，能够与LOR结合。在体外细胞评价实验中，

7、通过MTT实验考察SLP/LOR的肿瘤细胞抑制效果，结果显示抑制率超过30%；通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察考察细胞摄取情况，结果显示SLP能够将LOR大量递送进肿瘤细胞，具有较好的转染效果。采用RT-PCR法测定R1mRNA，结果显示其在HepG2细胞中对R1mRNA的下调效率为39.1%。与StA-R8相比提高了19.2%。采用Western-blot法测定R1蛋白表达量，结果显示，SLP组的R1蛋白下调效率明显高于StA-R8组。3.StA-R8脂质体/siRNA传递系统的建立和评价本文同

8、时对改性多聚精氨酸制备的阳离子脂质体装载一种靶向survivin基因的siRNA，并对其性质进行评价。首先对SLP/siRNA的N/P比进行优化，以粒径和电位作为指标，结果表明当N/P≥6时，可形成稳定的纳米粒子。琼脂糖凝胶电泳试验得到SLP在N/P比大于6时，SLP与siRNA完全结合。同时对SLP与siRNA形成的纳米粒子进行体外细胞实验研究。通过MTT实验考察SLP/siRNA的肿瘤细胞抑制效果，结果显示抑制率超过35%；通过流式细胞术和激光共聚焦