基于叶酸改性聚乙烯亚胺接枝壳聚糖受体介导的基因转染研究

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1、学校代码10459学号或申请号Z201528473密级硕士学位论文基于叶酸改性聚乙烯亚胺接枝壳聚糖受体介导的基因转染研究作者姓名：陶燕导师姓名：张振中教授学科门类：制药工程专业名称：制药工程培养院系：药学院完成时间：2018年11月AdissertationsubmittedtoZhengzhouUniversityForthedegreeofMasterInvestigationonGenetransfectionmediatedbyreceptorbyuseofPolyethyleniminegraftedchitosanwith

2、modificationofFolateAcidByYanTaoSupervisor:ZhenzhongZhangPharmaceuticalEngineeringSchoolofPharmaceuticalSciencesNovember2018原创性声明本人郑重声明：立进行研所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独。宄所取得的成果除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位

3、论文作者：陶燕日期：２０１８年１１月１５日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州、大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时一，第署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规

4、定。学位论文作者：陶燕陶泰日期；２０１８年１１月１５日摘要研究目的：壳聚糖（Chitosan，CS）是一种典型的阳离子线性多糖，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖单元通过β-（1,4）糖苷键连接构成。壳聚糖可与DNA通过正负电荷相互作用形成复合物，并且可以对DNA起到保护作用，使其免受DNA酶的降解，被认为是一种良好的基因运送载体。但是壳聚糖在基因递送过程中，具有低转染效率和低特异性，质子缓冲能力差等问题。我们为了提高其基因转染效率和质子缓冲能力，采用聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）进行修

5、饰，PEI具备高电荷密度、良好的DNA结合能力，其质子海绵效应可以促进胞内逃逸。并将叶酸（Folate，FA）连接在载体上以期提高载体的靶向治疗作用。相关研究表明，癌细胞之所以能够逃避机体免疫系统的识别，其中很重要的一个原因就是其表面具有高表达的PD-L1。为此，我们构建了可以靶向PD-L1的RNAi表达质粒shPD-L1。CS-PEI-FA纳米复合物负载治疗基因shPD-L1用于乳腺癌的治疗。研究内容与结果：（1）合成与表征：利用马来酸酐（Maleicanhydride，MAH）活化壳聚糖的氨基，PEI与CS活化的氨基反应合成CS-

6、PEI。将FA连接在PEI上。载体的结构确定是使用核磁共振和红外光谱。载体的粒径和形态分别使用动态光散射技术、透射电镜表征，粒径分布均匀，在200nm左右，呈现类圆形。DNA凝胶阻滞实验表明载体可负载DNA。通过对载体的pH缓冲效应进行表征，实验结果表明纳米载体CS-PEI-FA具有良好的质子缓冲能力。（2）体外细胞水平：以MCF-7为细胞模型，为了考察载体的体外生物相容性，我们进行了细胞毒性，细胞周期和凋亡考察。细胞毒性结果显示在给定浓度范围内细胞存活率高于80%；细胞周期结果显示载体负载DNA前后的G1期、S期、G2期与NC组相比

7、，未呈现明显差异（P＞0.05）；细胞凋亡结果表明各组细胞各周期的细胞数目与NC组没有显著性差异（P＞0.05）。表明载体负载DNA前后呈现良好的体外生物相容性。随后我们进行了细胞摄取及摄取机制的考察，结果显示细胞摄入4h时CS-PEI-FA和CS-PEI-FA/DNA即可具有良好的摄取效率，摄取机制考察结果显示低温和FA的加入可显著抑制细胞对CS-PEI-FA/DNAI的摄取，细胞对CS-PEI-FA/DNA的摄取具有能量依赖性，是通过FA特异性受体介导的途径摄取进入细胞。为了考察载体是否可以将质粒携带进入细胞并进行表达，我们进行了

8、体外细胞转染实验，荧光显微镜能定性观察到荧光，流式细胞仪定量检测转染率为72.1%。CS-PEI-FA包载治疗基因shPD-L1进行荧光实时定量PCR实验和westernblot实验，CS-PEI-FA/shPD-L1的