三氧化二砷联合维a酸对恶性黑色素瘤细胞株a375增殖、迁移能力影响和其可能分子机制探析

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1、三氧化二砷联合维A酸对恶性黑色素瘤细胞株A375增殖、迁移能力影响和其可能分子机制探析　　[摘要]目的研究三氧化二砷（As2O3）联合维A酸对恶性黑色素瘤细胞株A375的增殖、迁移能力影响及其可能的分子机制。方法常规培养黑色素瘤细胞株A375，分为空白对照组（不含药物的DMEM处理）、As2O3组（10μmol/LAs2O3）、全反式维A酸（at-RA）组（10μmol/Lat-RA）、As2O3+at-RA组（10μmol/LAs2O3联合10μmol/Lat-RA）。MTT法检测细胞活力，划痕试验检测细胞迁移能力，Western-blot法检测MMP-2、Ca

2、spase-2的蛋白水平。结果①As2O3+at-RA组的细胞活力为（35.8±7.3）%，低于As2O3组的（62.4±10.3）%和at-RA组的（59.3±11.3）%，差异有统计学意义（P　　黑色素瘤是一类具有高度恶性生物学行为的皮肤肿瘤，来源于皮肤基底部的黑色素细胞。近年来，我国的黑色素瘤发病率不断升高，年发病例数已超过106000例[1]。早期发现的患者可通过手术切除；中晚期患者则缺乏有效的治疗手段，手术切除困难，化疗效果不佳。基于黑色素瘤增殖、迁移等恶性生物学行为，探寻能够抑制该生物学行为的治疗方式具有积极的临床应用前景[2]。本研究通过培养恶性黑色

3、素瘤细胞株A375来分析三氧化二砷（As2O3）联合维A酸对其增殖、迁移能力影响及其可能的分子机制，现报道如下：1材料与方法1.1材料恶性黑色素瘤细胞株A375购买于中科院细胞库；DMEM培养基和胎牛血清均购买于Gbico公司；抗体购买于Abcam公司；离心管和细胞培养板购买于Corning公司；全反式维A酸（at-RA）、As2O3等药品购买于Sigma公司。1.2方法1.2.1细胞复苏和培养方法将细胞从液氮罐中取出后迅速置于37℃水浴锅中，并将细胞悬液移入15mL离心管中，1000r/min离心10min，弃上清后用5mL含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，

4、移入培养瓶中在37℃、5%CO2孵箱中培养。当细胞铺满70%～80%且处于对数生长期时，用胰酶常规消化，传代并接种于12孔板。1.2.2细胞处理方法当12孔板内细胞铺满70%～80%后，将含血清的DMEM更换为不含血清的DMEM培养24h，而后分别用不含药物的DMEM（空白对照组）、10μmol/LAs2O3（As2O3组）、10μmol/Lat-RA（at-RA组）、10μmol/LAs2O3联合10μmol/Lat-RA（As2O3+at-RA组）处理。24h后进行相应检测。1.2.3MTT法药物处理24h后，小心吸去上清，加入1606μLDMEM培养基、40

5、μL0.5%MTT溶液，孵箱中继续培养4h，而后吸尽上清，每孔加入200μL二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10min，而后在酶标测仪上检测490nm处的吸光值，计算细胞活性。其中，以空白对照组细胞的增殖能力为100%，分别计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组细胞增殖能力的相对值。1.2.4划痕试验加药处理同时用无菌的200μL枪头沿细胞孔中央在孔底部做一划痕，于镜下观察并拍照记录（0h）；放回孵箱继续培养24h，而后取出培养板于镜下观察并拍照记录（24h）。所得图像用ImageJ分析，计算0h和24h时划痕的面积A0和A24，以（A0-A24）

6、/A0反映细胞的迁移能力。其中以空白对照组细胞的迁移能力为100%，分别计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组细胞迁移能力的相对值。1.2.5Western-blot法在细胞孔内加入60μL蛋白裂解液RIPA，用细胞刮刀刮碎细胞后转移至1.5mL离心管内，于4℃、12000r/min离心10min，取上清通过BCA法进行蛋白浓度定量，上样量按每孔80mg总蛋白计算。配置4%的浓缩胶和10%的分离胶，点样后进行100V、20min，120V、90min的垂直电泳和100V、90min的电转膜。完成后取出NC膜投入5%脱脂牛奶中，室温封闭2h，而后在

7、TBST溶液中震荡洗涤56min×3遍，根据分子量裁剪NC膜并分别加入2%BSA溶液配置的1∶1000的MMP-2、Caspase-9、actin第一抗体，4℃摇床孵育过夜。第2天取出NC膜，TBST溶液中震荡洗涤5min×3遍，加入5%脱脂牛奶配置的1∶1000的HRP标记的种属特异行第二抗体、室温孵育2h后在TBST溶液中震荡洗涤10min×3遍。最后进行显影。计算蛋白条带的灰度值，以Tob灰度值/actin灰度值作为蛋白含量，令对照组的目的基因蛋白含量的均值为100%，计算As2O3组、at-RA组、As2O3+at-RA组的蛋白含量。1.3统计学方法采用S

8、PSS18