阿维a酸联合tnf-a对人黑色素瘤细胞株a375增殖抑制及诱导分化研究

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1、河北医科大学硕士学位论文阿维A酸联合TNF--a对人黑色素瘤细胞株A375增殖抑制及诱导分化研究姓名：王峰申请学位级别：硕士专业：皮肤病与性病学指导教师：丁政云201203中文摘要阿维A酸联合TNF．a对人黑色素瘤细胞株A375增殖抑制及诱导分化研究摘要目的：恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM)是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤，多发生于皮肤，占所有皮肤恶性肿瘤的第三位。其恶性程度高，早期易发生淋巴和血道转移，愈后差。手术切除、生物治疗、放射治疗及化学治疗是恶性黑色素瘤通常采用的治疗方法，但效果均不

2、理想。随着早期诊断、外科手术及辅助治疗的发展，早期患者通过手术多可以治愈，5年生存率约95％，但进展期患者中生存期仅2．8个月，5年生存率不足5％。传统化疗对恶性黑色素瘤的疗效较差，因此，寻求疗效好、毒副作用小的新的治疗方法和药物是肿瘤学者研究的热点问题。维甲酸类(retinoid)是一组包括维生素A的天然及人工合成的衍生物，具有抗增殖及诱导分化等作用，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，是一种有效预防皮肤肿瘤的药物。其抗皮肤黑色素瘤的机制尚未完全阐明。TNF．a具有广泛的生物学活性，具有强大的抗肿瘤作用，是迄今发现的抗

3、肿瘤作用最强的细胞因子，但其副作用较大。二者联合应用，有可能提高肿瘤对诱导剂的敏感性，增强抗肿瘤作用，从而降低单药剂量，减少毒副作用，也可提高治疗效果。本研究旨以人黑色素瘤细胞株A375为研究对象，探讨维甲酸、TNF．a在不同浓度、不同作用时间对皮肤黑色素瘤细胞增殖抑制作用及形态分化的影响，筛选两药联合应用的最佳作用时间和剂量；探讨阿维A酸及两药联合应用对人A375细胞表达MlVIP．1、TIMP．1的影响。为TNF．a、维甲酸类药物诱导皮肤肿瘤细胞凋亡的基础研究及临床应用提供实验依据。方法：1细胞培养将A375

4、恶性黑色素瘤细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素100U／ml，含链霉素100U／ml，PH7．2)中，放入37℃、5％C02的培养箱内进行常规传代培养。．2采用MTT比色法检测阿维A酸及阿维A酸联合TNF—a对A375细胞增中文摘要殖的抑制作用。3倒置相差显微镜观察各组药物处理后A375细胞的分化及形态变化。4应用免疫细胞化学s．P法，检测不同浓度药物处理后A375细胞MMP．1、TIMP．1蛋白的表达状况。5采用流式细胞分析技术，检测A375细胞周期变化和凋亡。6采用统计软件SPSSl3．0对

5、数据进行统计分析。采用单因素方差分析，以a=0．05为显著性差异标准。结果：1MTT比色分析法检测各处理因素对人A375细胞增殖的影响(相对抑制率)。1．1阿维A酸组：浓度不同的阿维A酸组与对照组相比，阿维A酸在0．1umol／L至100umol／L范围内对人黑色素瘤A375细胞有明显的增值抑制作用，且以100umol／L浓度组作用48h抑制率最高。统计分析表明，在12、24及48三个时间段，阿维A酸对人黑色素瘤细胞A375的抑制作用呈现明显的剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系，各组间差别具有显著性(p

6、)。而10、100lmaol／L两组间比较，其抑制作用差异无统计学意义(P>0．05)1．2阿维A联合TNF．a组：将实验分为3组，分别为阴性对照组(不加任何药物)，TNF．a组(5u／L)及阿维A酸(10umol／L)联合TNF—a(5讥)组。上述各组作用A375细胞48小时后，MTT法检测实验组抑制率TNF组为38．60％，联合组为58．45％，联合组明显高于对照组11．85％和阿维A酸组43．65％，可见阿维A酸和TNF．a联合应用明显抑制A375细胞增殖，与阿维A酸、TNF．a单独应用比较，差异具有显著性

7、(p

8、5细胞MMP．1、TIMP．1蛋白表达情况MMP．1、TIMP．1蛋白主要表达于细胞浆内，DAB染色为棕黄或棕褐色。经不同浓度药物处理后的细胞蛋白阳性表达的程度不同，阴性对照组细胞MMP．1高表达，TIMP．1低表达，在阿维A组及联合用药组A375细胞中，MMP．1及TIMP—l蛋白表达均降低，且联合组MMP．1及TIMP．1蛋白表达降低更明显，差异具有显著性(p