肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株ht29耐奥沙利铂中作用探析

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1、肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中作用探析　　[摘要]目的探讨肿瘤干细胞（cancerstemcell，CSC）在人结肠癌细胞株HT29对奥沙利铂（L-OHP）产生获得性耐药中的作用。方法采用浓度递增法诱导产生人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HT29/L-OHP。采用As2O3逆转HT29/L-OHP的耐药性。采用MTT法检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP的增殖能力和对L-OHP的敏感性。采用实时荧光定量PCR检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP中Sox-2、miR-200c和let-7的表达。结果①在L-OHP（12μmol/L）的作用下，H

2、T29/L-OHP的增殖能力显著高于HT29（P0.05）。HT29和HT29/L-OHP对L-OHP的IC50分别为12.1μmol/L和138.4μmol/L，耐药指数为11.44。②0.20mg/L的As2O3预处理后，降低了HT29/L-OHP对L-OHP的耐药性，逆转倍数为3.76，相对逆转效率为80.4%。③相对于HT29，HT29/L-OHP中Sox-2的表达显著增加[（0.072±0.038）比（0.019±0.010）]（P　　1.2.7As2O3对HT29/L-OHP细胞耐药性的逆转根据细胞毒性实验结果，选取无细胞毒剂量的As2O3进行实验。

3、加入As2O3727h后测定HT29/L-OHP细胞对L-OHP的敏感性，计算IC50，并计算逆转倍数和相对逆转效率。逆转倍数=HT29/L-OHP的IC50/加入As2O3后HT29/L-OHP的IC50。相对逆转效率=（HT29/L-OHP逆转前IC50-HT29/L-OHP逆转后IC50）/（HT29/L-OHP逆转前IC50-HT的IC50）。1.2.8实时荧光定量PCR1.2.8.1引物设计采用引物在线软件设计引物并检测分析（blast.ncbi.nlm.nih.gov），最后由上海生物工程有限公司合成，引物序列（5’→3’）见表1。1.2.8.2总R

4、NA的提取和逆转录取对数生长期的耐药株和亲本株HT29细胞，采用RNA提取试剂盒提取总RNA并进行逆转录反应，得到的cDNA用于实时荧光定量PCR。1.2.8.3实时荧光定量PCR反应反应体系：SYBRPremixExTaqTM（2×）10μL，Forwordprimer0.4μL，Reverseprimer0.4μL，ROXReferenceDye（50×）0.4μL，cDNA2μL，dH2O6.4μL。反应条件：95℃变性15min，扩增40循环，每循环变性15s，60℃退火30s，72℃30s。采用△△Ct法进行相对定量分析。1.3统计学方法采用SPSS7

5、10.0统计软件包进行数据处理，计量资料进行方差齐性分析和正态分布检验，方差齐且呈正态分布的数据，组间比较采用单因素方差分析；方差不齐或者非正态分布数据均进行变量变换，变换后再进行方差齐性分析和正态分布检验，若变换后仍方差不齐或者非正态分布的数据，对其进行非参数检验。以P0.05），但是在第3～7天，HT29/L-OHP细胞增殖速度显著高于HT29细胞（P0.05）（图1），HT29/L-OHP细胞的倍增时间接近于无L-OHP作用的HT29细胞（26.3h）。MTT结果显示，HT29/L-OHP细胞的IC50为138.4μmol/L，HT29细胞的IC50为12

6、.1μmol/L，RI为11.44。2.2As2O3细胞毒性实验结果结果表明，0.25mg/L的As2O3对HT29细胞无毒性反应，但是当浓度超过0.25mg/L时，As2O3呈现出剂量依赖性的毒性效应（表2），可以认为0.20mg/L的As2O3为无细胞毒性剂量。2.3As2O3对HT29/L-OHP细胞耐药性的逆转As2O3（0.20mg/L）预处理后，MTT结果显示，在L-OHP（12μmol/L）存在的情况下，在第1～5天时，HT29/L-OHP和HT29细胞的增殖速度差异无统计学意义（P>0.05，图2），但是在第6、7天，HT29/L-OHP细胞增殖

7、速度显著高于HT29细胞（P0.05，图2），但是在第3～7天，HT29/L-OHP细胞的增殖速度降低（P7　　多项研究表明，CSC是多种肿瘤细胞产生化疗药物耐药性的重要机制之一[7-8]，但是CSC在结肠癌细胞对L-OHP耐药中的作用并不清楚。为了探讨CSC是否参与了结肠癌细胞的耐药过程，本研究采用实时荧光定量PCR观察了与干细胞相关的标记物的表达。Sox-2是一种具有很强特异性的胚胎干细胞标记物，在干细胞中的表达较强[9-10]。miR-200c和let-7是两种微小RNA，与肿瘤的发生发展、侵袭和分化等过程密切相关，在CSC中表现为低表达[11-12]。本

8、研究中，相对于HT29细