酶联免疫检测技术教学提纲.ppt

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1、酶联免疫检测技术实验目的验证酶联免疫吸附试验的基本原理掌握双抗体夹心酶联免疫法的基本原理掌握酶联免疫试剂盒的基本组成熟悉酶联免疫操作方法实验内容简介酶联免疫吸附试验是最常用的酶联免疫分析技术，有四种基本类型：夹心法（双抗体夹心和双抗原夹心）、间接法、竞争法、捕获法。本实验以双抗体夹心法测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）为例，验证酶联免疫吸附试验的基本原理。实验原理双抗体夹心法筛选两种抗-HBsAg（针对不同抗原表位），一种连接于固相载体制备酶标反应板；另一种标记过氧化物酶制备酶标抗体。测定时，待测抗原分别与

2、固相抗体和酶标抗体结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体双抗体夹心复合物。实验材料ELISA试剂盒预包被抗体酶标反应板系列标准品抗原酶标抗体（抗HBsAg-HRPO）质控血清显色底物终止液浓缩洗液实验方法制备酶标板包被封闭实验准备标本编号所有试剂平衡至室温稀释洗液实验方法操作步骤加标准品或待测样本，37℃温浴30min；洗涤3~5次，加酶标记抗体；37℃温浴30min；洗涤3-5次，加显色液A和显色液B；室温15min，再加入终止液;读取A450nm绘制标准曲线采用Logistic曲线拟合剂量反应曲线结果判断准

3、确使用微量加样器所有试剂需平衡至室温加入试剂或标本后需轻轻振荡洗涤过程要标准化注意事项实验讨论问题:HBsAg定量分析的临床意义？酶联免疫吸附试验的注意事项？如何检测抗-HBsAg？天津医科大学李会强实验二酶免疫组织化学染色技术（验证性实验）实验目的验证酶免疫组织化学技术的原理掌握PAP-酶免组化法的检测原理熟悉PAP-酶免组化技术操作要领实验内容简介酶免疫组织化学技术集抗原抗体结合的特异性、酶免疫分析的敏感性和组织化学技术的直观性特点为一体，常用于细胞鉴定、抗原定位、病理组织观察等方面。本实验以辣根过氧化

4、物-抗辣根过氧化物免疫组化技术检测成熟CD3+T细胞为例，对这一技术的原理和操作流程进行验证。实验原理要点：特异性抗体识别抗原PAP复合物的放大效应桥联抗体连接作用实验材料一抗（识别抗体）：抗CD3抗体PAP复合物：过氧化物酶抗-过氧化物酶二抗（桥联抗体）：兔抗鼠Ig实验方法分离外周血单个核细胞采用密度梯度离心法分离制片免疫反应加一抗，37℃60min洗涤玻片3次同时加桥联抗体和PAP复合物，37℃30min洗涤玻片3次加底物显色镜检注意事项制片时，细胞均匀，密度适中免疫反应过程中，洗涤充分湿盒中反应，防止

5、干片镜检时，注意区分特异和非特异结果分析采用高倍镜观察计数。将待检载破片置普通光学显微镜下观察，阳性细胞呈棕黄色，计数200个细胞，计算CD3+细胞的百分比。实验讨论思考题：酶免疫组织化学技术的影响因素有哪些？在酶免疫组织化学技术中，为何不直接将酶蛋白标记在抗体分子上？酶免疫组织化学技术有何优点？天津医科大学李会强实验三酶联免疫试剂盒的研制（设计性实验）实验目的熟悉酶联免疫试剂盒研制要点抗原纯化与抗体制备制备酶标记抗原（或抗体）方法选择与设计筛选抗体（抗体匹配）优化反应条件实验相关知识简介理论知识酶联免疫吸

6、附试验相关技术蛋白纯化酶标记化合物制备酶标反应板制备实验要求题目：假设需采用酶联免疫法测定某种肿瘤标志物，设计实验如何制备酶联免疫试剂盒？要求：设计实验方案，绘制技术路线图说明重要实验内容和实验方法实施策略重要环节：纯化抗原和制备抗体方法学选择与设计抗原抗体选择抗体匹配（双抗体夹心法）确定工作浓度优化反应条件总结与讨论问题：研制酶联免疫试剂盒需做哪些准备工作？如何根据待测物质特性选择合适反应类型？双抗体夹心法如何进行抗体匹配实验？理想剂量反应曲线应具备哪些条件？天津医科大学李会强实验四定量酶免疫分析中标准曲

7、线的数学模型（设计性实验）实验目的掌握常用标准曲线数学模型线性回归法logistic曲线拟合实验相关知识简介理论知识基本变量分析物浓度和信号强度免疫分析的特殊性待测物浓度影响反应速率曲线拟合方式影响测定结果实验要求题目：根据所给数据，绘制标准曲线或得出数学模型。CEA浓度（ng/ml）0102050100200400A值0.0540.3300.4560.7791.2311.7262.397实施策略两种方式拟合四参数Logistic曲线拟合Logit-log直线回归总结与讨论问题：直线回归有几种常用方式？说明

8、各自特点。曲线拟合有几种常用方式？说明各自特点。如何评价剂量反应曲线拟合方式？天津医科大学李会强此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢