激光扫描共聚焦显微GHX教学文稿.ppt

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1、激光扫描共聚焦显微GHXLSCM的发展1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美国的专利。1967年成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。1970年牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。1987年White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能

2、也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。HippocampusneuronsexpressingGFPLSCM与普通荧光显微镜的图像质量比较荧光显微镜LSCMLSCM的重要组件主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。激光器显微镜：物镜载物台计算机系统：图像分析与控制系统激光扫描共聚焦显微镜vs荧光显微镜激光扫描共聚焦显微镜荧光显微镜激光作为光源的优点单色性强谱线宽度可小于10-8nm方向性强发射角仅为毫弧度数量级高亮度相干性好

3、基于上述主要特点，激光作为扫描共聚焦显微镜的光源是最理想的波长功率（mW）激光器类型325351457-514543.5632.8700-1100115210-30300251.253.520001氦镉(He-Cd)激光器带紫外的水冷氩离子激光小型氩离子激光绿氦氖(He-Ne)激光红氦氖(He-Ne)激光蓝宝石激光氦氖(He-Ne)激光激光扫描共聚焦显微镜中常见的激光器激光器显微镜LeicaDMIRBE倒置荧光显微镜物镜LSCM物镜的重要参数NA数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。是物镜的主要技术参数，是判断物镜性能高低的重要标志。N.A

4、=n*sina/2n：物体与物镜间媒质的折射率a2：物镜孔径角的一半溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的为1.3，空气为1。香柏油与玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。N.A.越大：放大倍数越大，分辨率越高，N.A.越大：视场宽度与工作距离越小MagnificationNumericalApertureWorkingDistance(mm)AchromatCorrection4x0.1030.0010x0.256.1020x0.402.1040x0.650.6560x0.800.30100x(oil)1.

5、250.184x20x10x40x60x100x载物台计算机系统图像分析与控制系统分析软件控制软件+激光共聚焦显微镜原理图1.共聚焦显微镜简化原理图用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色镜(Dichroicmirror)反射，通过显微物镜(Objectivelens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focalpoint)处。激光照射所产生的荧光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比

6、较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detectionpinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。共轭图2.探测针孔的作用示意图（解释了出射小孔所起到的作用）只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射

7、小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focalpoint)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术。LSCM扫描图像方式单一光学切片扫描(singleopticalsection,x-y)时程活细胞扫描(timelapselivecellimaging,x-y-t)三维扫描及重构(3-Dreconstruction,x-y-z)四维扫描(4-Dimaging,x-y-z-t)ZXYXY平面单一光学切片扫描(singleopticalsection,x-y)Opticalsectionscoll

8、ectedsimultaneouslyatthreedifferentexcitationwavelengths(488,568,and647nanometers).Thespecimenis