酸性木聚糖酶检验操作规程

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1、木聚糖酶检验操作规程1酶活定义在50℃，pH4.80酸性条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的燕麦木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU），还原糖以木糖等量。2原理在一定温度和pH条件下，木聚糖酶将木聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生还原糖的量成正比，还原糖生成量与反应液中木聚酶活力成正比，通过分光比色测定反应液吸光度，可计算木聚酶活力。3仪器和设备3.1分析天平：感量0.0001g3.2精密pH计：精确至0.

2、013.3磁力加热搅拌器3.4分光光度计：应符合GB9721有关规定，0.5cm比色皿3.5电热恒温水浴锅：30～100℃，±0.1℃3.6计时器：每小时误差不超过五秒3.7移液器：100～1000μL3.8微量进样器：0～50μL4试剂和溶液4.1试剂：柠檬酸C6H8O7·H2O柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O酒石酸钾钠KOCO(CHOH)2COONa·4H2O3,5-二硝基水杨酸C7H4N2O7氢氧化钠NaOH苯酚C6H5OH无水亚硫酸钠Na2SO34.1缓冲液配制：取柠檬酸C6H8O7·H2O5.4克与

3、柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O21.9克用950ml蒸馏水溶解，测定pH，用3.0mol/l 的盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH至4.80,定容至1000ml。4.210mg/ml木聚糖：精密称取燕麦木聚糖(sigmaX-0627)1.0000g，置40mL0.1M的氢氧化钠溶液中，于70℃下磁力加热搅拌2小时。冷却至室温，用3M盐酸溶液调pH值至4.80，然后用4.1缓冲液定容至100ml。标记为1.0%木聚糖溶液，同时标记pH及配制日期。4℃条件下保存，有效期7天。4.310mg/mL的标准木糖溶液：精密称

4、取无水木糖1.0000置80mL蒸馏水中搅拌溶解，待完全溶解后定容至100mL。标记为10mg/mL的标准木糖溶液，同时标记配制日期，4℃条件下保存。4.4DNS试剂的配制称取3,5-二硝基水杨酸31.50g缓慢加入5000mL蒸馏水中，不断搅拌，水浴至45℃，逐步加入1000mL氢氧化钠溶液（e），不断搅拌至溶液清澈透明（在加入氢氧化钠溶液过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加入四水酒石酸钾钠910.0g、苯酚25.0g、无水亚硫酸钠25.0g，继续45℃水浴加热，同时补水3000mL，不断搅拌，至上述物质完

5、全溶解后，冷却至室温，并定容到10000mL。用滤布过滤，将滤液储存于棕色瓶中，标识名称和配制日期，避光，室温保存7天后可以使用。有效期6个月。5分析步骤5.1标准曲线的绘制：取8支试管按下表加入相关试液后再加入1.5mLDNS试剂,充分摇匀，置沸水浴中反应5min，迅速冷却至室温，用水定容至5.0mL，用0号试管试液作对照，在540nm波长下测其它各试管试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以木糖含量为横坐标绘制标准曲线。试管号01234567缓冲液加入量（μL）1000990985980975970965960木糖标

6、准液加入量（μL）010152025303540木糖含量（μg）01001502002503003504005.2待测酶液的制备：5.2.1液体酶：用缓冲液稀释原酶液，控制待测酶液的浓度在0.19-0.22IU/ml之间。5.2.2固体酶：精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中（稀释倍数≤500倍的直接用缓冲液溶解）；室温下磁力搅拌10min；用100mL容量瓶定容。离心后取上清液用缓冲液（d）稀释，控制待测酶液的浓度在0.19-0.22IU/ml之间。5.3水平控制：取已知酶活力的木聚糖酶，按样品酶

7、稀释方法进行稀释，控制待测酶液的浓度在0.19-0.22IU/ml之间。5.4酶活力的测定：5.4.1取三支试管各加入0.5mL木聚糖底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。5.4.2在第一、二试管中各加入0.5ml待测酶液，并计时，50℃水浴中反应15min。5.4.3反应完后在三支试管中各加入1.5mL的DNS试剂，并在第三支试管中补加0.5mL的待测酶液。5.4.4取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。5.4.5迅速冷却至室温，用水定容到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第

8、一、二试管试液的吸光度。吸光度在0.25～0.30之间为宜，若不在此范围需改变稀释倍数重测。5.4.6待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。6活力的计算酶活力（IU/mL或IU/g）=(木糖等量值/150/15/0.5)×n式中：150：木糖从微克换算成微摩尔15：待测液与底物的反应时间0.5：加入反应的待测酶液量n：