木聚糖酶检测方法

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1、木聚糖酶活力的测定分光光度法1原理木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用Xylanfromoatspelt，燕麦木聚糖，SigmaNO.:X0627）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。2木聚糖酶活力单位（U）的定义在40℃、pH值为5.0的条件下，1.0min从浓度为5mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1µmol还原糖（以木糖表示）所需要的酶量为一个酶活力单位（U）。其中样

2、品的酶活力以U/g（固体酶）或U/mL（液体酶）表示。桦木木聚糖（Xylanfrombirchwood）山毛榉木聚糖（Xylanfrombeechwood）3主要仪器3.1分光光度计3.2精密电子天平精确至0.0001g。3.3恒温水浴锅30-60℃可调，精度为0.1℃。3.4酸度计精确至0.01。3.5秒表每小时误差不超过5s。3.6刻度试管（15mL）带玻璃塞，10支以上。3.7移液管（0.5、1、2、5、10mL）3.8分样筛孔径为0.25mm（60目）。3.9分析天平精确至0.001g。3.10磁力搅拌器附加热功能。3.11电磁振荡器3.12烧结玻璃过滤器孔径为0.45μm。3.13

3、离心机3000r/min3.14冰箱4试剂与溶液配制除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T6682中规定的二级水。4.1氢氧化钠（NaOH）溶液（浓度为200g/L）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。4.2乙酸（CH3COOH）溶液（浓度为0.1mol/L）吸取冰乙酸0.60mL，加水溶解，定容至100mL。4.3乙酸钠溶液（CH3COONa）（浓度为0.1mol/L）称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100mL。4.4乙酸——乙酸钠（CH3COOH—CH3COONa）缓冲溶液（浓度为0.1mol/L，pH为5.0）称取三水乙酸钠19.17g，加入冰

4、乙酸3.60mL。再加水溶解，定容至2000mL。测定溶液的pH值。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。用精密pH试纸检定。4.5木糖（C5H10O5）溶液（浓度为10.0mg/mL）称取无水木糖1.000g，加乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100mL。4.6木聚糖溶液（浓度为10.0g/L）称取木聚糖（SigmaX0627）1.00g，加入0.32g氢氧化钠，再加入90mL水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30min，加入0.8mL冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其pH值。如果pH值为5.0，用乙酸——

5、乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0，然后再用乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100mL。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4℃避光保存，有效期为3天。4.7DNS试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯），加水500mL，搅拌5s，水浴至45℃。然后逐步加入100mL氢氧化钠溶液（4.1），同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃。）。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL

6、，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期为6个月。4.8乙酸——乙酸钠2号缓冲溶液量取100mL乙酸——乙酸钠1号缓冲溶液，加入0.15gTritonX-100（曲拉通100），0.15g牛血清白蛋白（BSA）混合均匀。如果pH值偏离5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。5标准曲线的绘制吸取乙酸——乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0mL，加入DNS试剂（4.7）3.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温，用水定容至15.0mL，制

7、成标准空白样。分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.007.00和8.00mL，分别用缓冲溶液（4.4）定容至100mL，配制成浓度为300、400、500、600、700、800μg/mL木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标准溶液各1.00mL（做三个平行），分别加入到刻度试管中，再分别加入1.0mL缓冲液（4.4）（终浓度分别为：0,150，200，250，300，350和40