定量蛋白质组学研究技术知识讲解.ppt

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1、定量蛋白质组学研究技术细胞工程教研室细胞工程教研室主要内容定量技术体系与分类荧光染料分析法同位素标记技术针对性亲和标签技术同位素标记技术的应用细胞工程教研室一定量技术体系和分类技术体系双向电泳-质谱技术体系蛋白质芯片分析体系基于同位素标记的质谱分析技术体系细胞工程教研室2-DE-MS技术体系无标记的蛋白质双向电泳荧光差异凝胶电泳基于同位素标签和自动化的串联质谱细胞工程教研室定量分析方法定性差异分析和定量差异分析绝对定量和相对定量凝胶差异分析和非凝胶差异分析标记定量法和无标记定量法细胞工程教研室二荧光染料分析法双向电泳（2-DE）凝胶染

2、料显示考马斯亮蓝银染荧光染色荧光标记细胞工程教研室荧光双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）目前，在传统2-DE技术的基础上发展出的2D-DIGE，采用专有的荧光染料（Cy2、Cy3、Cy5）与多重样本和图象分析的方法，在同一块胶上可同时分离多个由不同荧光标记的样品，并以荧光标记的样品混合物为内标，对每个蛋白质点和每个差异都可以进行统计学可信度分析，从而具有良好的重复性和较高的准确率。另外，由于荧光染料的使用，使得2D-DIGE具有高灵敏度的特性，能够满足高通量定量蛋白质组学研究分析的要求。细胞工程教研室细胞工程教研室荧光扫描仪细胞工程教

3、研室细胞工程教研室三同位素标记技术原理多肽和蛋白质的质谱响应值受许多难以控制的因素的影响，特别是其离子化效率受其他物质和条件的影响很大，具有很强的体系依赖性，因而不能对来自相同肽段两次质谱检测得到的信号强度像色谱定量中那样进行比较定量。细胞工程教研室一个肽的惟一适合的内标准是标记有稳定同位素的同一个肽。所以，在完整蛋白或消化后的多肽中引进稳定同位素（如2H、13C、15N、18O）标记的小分子，用来识别不同样品来源的肽段，经“轻”质和“重”质同位素标记的不同多肽互相作为内标，化学性质基本上是一样的，这样就可以确保同一次质谱扫描中两者的

4、离子化效果是相同的，此时肽质谱峰信号成对出现，质谱峰的信号强度就可以作为定量的依据。它们的相对强度就精确地反映了原样品中多肽的比例（也就是蛋白的比例）。细胞工程教研室分类同位素标签引入方法生物代谢方式化学方式酶解过程引入同位素标记引入法体内标记【代谢标记法（SILAC）】体外标记【化学标记法（ICAT）】细胞工程教研室生物代谢方式引入标记原理将一定量的相同种类但表达水平不同的两个（细胞）样品分别置于正常培养介质和富含某重质同位素（如：15N）的相同介质中培养，一定时间后将两者混合酶解，然后选择性亲和分离、色谱分离，并进行质谱分析。细胞

5、工程教研室方法15N/14N蛋白质标记技术分别用富含15N/14N的细胞培养基培养要比较的细胞或者简单生物体，通过生物代谢的方式以15N替代氨基酸组成中的14N，进而把15N标记引入蛋白质组成中。由于氨基酸组成的不固定（从甘氨酸的1个到精氨酸的4个），因此还没有把此标记用在细胞培养上的报道。细胞工程教研室细胞培养条件下稳定同位素标签技术（SILAC）通过细胞的正常代谢，把稳定同位素标记的氨基酸引入到蛋白质组成中，大大简化质谱定量分析前人工处理的复杂度。可用在细胞培养条件下的稳定同位素有：2H、13C和15N等。细胞工程教研室细胞工程教

6、研室酶解过程引入标记18O/16O水在两个要比较的蛋白质样品的酶解过程中分别加入18O和16O水，这样可特异性地对酶解肽段的C末端进行标记，等量混合后进行质谱分析样品间蛋白质组的差异。混合样品须快速鉴定。酶解标记H218O在H218O的溶液中进行蛋白质酶解，可在其C端稳定结合1或2个18O原子。细胞工程教研室整体内标技术（GIST）通过用N-acetoxy-[2H3]-succinimide/N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化处理酶解肽段，把同位素标签引入样本分析体系中。NAS可标记必需氨基酸亲和肽段的N末端。

7、由于肽段的乙酰化位点不一，被标记的重链和轻链质量差也不固定，给自动化分析带来了一定困难。细胞工程教研室亲和标签法引入标记原理同位素标记亲和标签技术（ICAT）由Gygi等于1999年发明。此技术是利用同位素亲和标签试剂，预先选择性地标记某一类蛋白质，分离纯化之后进行MS鉴定。根据MS图上不同同位素标记亲和标签试剂标记的一对肽段离子的强度比值定量分析样品的相对丰度。细胞工程教研室ICAT试剂组成：反应基团（特异性结合肽链中半胱氨酸残基的巯基）连接子（结合稳定同位素）亲和标签—生物素（可与卵白素结合，选择性分离标记的多肽）细胞工程教研室操

8、作流程同位素标记亲和标签轻试剂标记的细胞蛋白质1同位素标记亲和标签重试剂标记的细胞蛋白质2混合，胰酶水解阳离子交换卵白素亲和层析LC分离，MS分析，数据库检索细胞工程教研室优点兼容任何生长条件下的组织中的蛋白质样品；烷基