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1、SILAC定量蛋白质组学SILAC定量蛋白质组学1：SILAC定量蛋白质组学原理2:应用2.1：SILAC定量蛋白质组学2.2:SILAC研究蛋白质相互作用2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用2.4：SILAC研究蛋白质与RNA相互作用1：SILAC定量蛋白质组学原理1.1：SILAC定量蛋白质组学的原理1.2：SILAC技术流程1.2.1：培养基准备1.2.2：细胞标记与测试1.2.3:实验处理1.2.3：蛋白质分离与质谱分析1.2.4：结果形式SILAC法。1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(
2、D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”；2、细胞处理，如药物处理；3、细胞裂解、提取蛋白质；4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色；5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。1.1：SILAC定量蛋白质组学原理1.1：SILAC定量蛋白质组学原理技术优势——目前比较蛋白质组学最先进方法（1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；（2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；（3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并
3、定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平；（4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记；（5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸，操作方便。1.2.1：培养基准备材料：（1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培养基，Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培养基。（2）：透析FBS。（3）：稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine
4、(15N2,D9),L-Lysine(4,4,5,5-D4),L-Arginine(13C6),L-Arginine(13C6,15N4),L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备：取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中，同时添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um滤膜过滤，4度保存备用。根据实验的需要，可以配制“中”型和“重”型培养基。1.2.2：细胞标记与测试标记：一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后，一天或2天传代一次，细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取
5、代。添加了稳定同位素（“中”或“重”型）的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢，这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分，可以让透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔径一般为10KDa.标记测试：在进行正式实验之前，需要对细胞进行标记测试，测试细胞中蛋白质的Lys和（或）Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取蛋白质后，等量混合，SDS-PAGE分离，LC-MS/MS检测。1.2.2：细胞标记与测试细胞经过传代培养7天后，同一肽段被“重”型肽段取代1.2.3:实验处理当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后，可以进行细胞处理，如药物处理，病
6、毒处理等。1.2.3：蛋白质分离与质谱分析（1）：提取“轻”型”，“中”型，“重”型细胞蛋白质，等量混合，SDS-PAGE分离，染色。（2）：割取蛋白质条带，胰蛋白酶酶切。（3）：LC-MS/MS（仪器：LTQOrbitrapXL™)分析，数据检索。1.2.4：结果形式LC-MS/MS分析结果，将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。肽段质谱峰图及表达量：2:SILAC应用2.1：SILAC定量蛋白质组学实例2.2:SILAC研究蛋白质相互作用2.3：SILAC研究蛋白质与DNA相互作用2.4：SILAC研究蛋白质
7、与RNA相互作用2.1：SILAC定量蛋白质组学实例2.1SchematicforSILACSILAC实验流程图2.1MSspectrashowingthefourmajorpatternsofphosphorylationobservedSILAC定量结果图例，质谱峰的高度表示蛋白表达的相对强度.SummaryoffoldchangewithHer2forall462proteins,withseveralindividualproteinshigh-lighted.Proteinswitharatio>1.5(upperredline)a
8、reconsideredasincreasedintheirtyrosinephosphorylationlevel,andthosewithratios<0.66
