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时间:2019-05-09
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1、SILAC定量蛋白质组学辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-1663SILAC定量蛋白质组学1:SILAC定量蛋白质组学原理2:应用2.1:SILAC定量蛋白质组学2.2:SILAC研究蛋白质相互作用2.3:SILAC研究蛋白质与DNA相互作用2.4:SILAC研究蛋白质与RNA相互作用辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631:SILAC定量蛋白质组学原理1.1:SILAC定量蛋白质组学的原理1.2:SILAC技术流程1.2.1:培养基准备1.2.2:细胞标记与测试1.2.3:实验处理1
2、.2.3:蛋白质分离与质谱分析1.2.4:结果形式辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-1663SILAC法。1、标记:在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培养细胞,使蛋白质被标记成“中型”或“重型”;2、细胞处理,如药物处理;3、细胞裂解、提取蛋白质;4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS-PAGE电泳、染色;5、割取蛋白质条带,胰蛋白酶消化,质谱分析。1.1:SILAC定量蛋白质组学原理1.1:SILAC定量蛋白质组学原理技术优势——目前比较蛋白质
3、组学最先进方法(1)高效性:SILAC是体内标记技术,标记效率可高达100%;(2)定量精确:线性范围广,降低由于样品制备不同而造成的实验内差异;(3)高通量、灵敏度高:可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质,且检可测测到纳克级水平;(4)相容性:可以对多种在DMEM或RPMI1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记;(5)灵活性:在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同位素标记的这两种氨基酸,操作方便。辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.1:培养基准备材料:(1):Lys或(和)Arg缺陷型1640培养基,L
4、ys或(和)Arg缺陷型DMEM培养基。(2):透析FBS。(3):稳定同位素标记的Lys和Arg。L-Lysine(13C6),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(15N2,D9),L-Lysine(4,4,5,5-D4),L-Arginine(13C6),L-Arginine(13C6,15N4),L-Arginine(13C6,15N4)。培养基制备:取相应量的稳定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培养基中,同时添加血清(一般是10%)和抗生素后,0.22um滤膜过滤,4度保存备用。根据实验的需要,可以配
5、制“中”型和“重”型培养基。辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.2:细胞标记与测试标记:一般细胞经过添加同位素的培养基传代培养5-6代后,一天或2天传代一次,细胞中蛋白质的Lys和Arg将被同位素氨基酸取代。添加了稳定同位素(“中”或“重”型)的细胞与“轻”型细胞相比细胞生长速度可能偏慢,这是由于透析血清与中缺乏一些盐成分,可以让透析血清在PBS里面透析,透析膜的孔径一般为10KDa.标记测试:在进行正式实验之前,需要对细胞进行标记测试,测试细胞中蛋白质的Lys和(或)Arg是否被相应的同位素氨基酸取代。收取蛋白质后,等量混合
6、,SDS-PAGE分离,LC-MS/MS检测。辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.2:细胞标记与测试细胞经过传代培养7天后,同一肽段被“重”型肽段取代辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.3:实验处理当标记测试检测到蛋白质已被同位素氨基酸标记后,可以进行细胞处理,如药物处理,病毒处理等。辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.3:蛋白质分离与质谱分析(1):提取“轻”型”,“中”型,“重”型细胞蛋白质,
7、等量混合,SDS-PAGE分离,染色。(2):割取蛋白质条带,胰蛋白酶酶切。(3):LC-MS/MS(仪器:LTQOrbitrapXL™)分析,数据检索。辉骏生物:http://www.fitgene.com/免费服务热线:400-699-16631.2.4:结果形式LC-MS/MS分析结果,将会给出每个肽段的质谱峰图及定量信息。结果将会已EXCEL表格呈现。肽段质谱峰图及表达量:2:SILAC应用2.1:S
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