蛋白质组学基本技术简介

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1、第二讲蛋白质组学基本技术简介（Ⅱ）二维电泳和生物质谱技术第一节双向凝胶电泳（Two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）Oldestmethodforlargescaleproteinseparation(since1975)StillmostpopularmethodforproteindisplayandquantificationPermitssimultaneousdetection,display,purification,identification,quantificationRobust,i

2、ncreasinglyreproducible,simple,costeffective,scalable¶llelizableProvidespI,MW,quantity2-Delectrophoresis(separation)MajortechniqueinproteomicresearchInterestedspotDigesttopeptidefragmentMSanalysis1.Firstdimension:denaturingisoelectricfocusingseparationaccordingtothep

3、I2.Seconddimension:SDSelectrophoresis(SDS-PAGE)SeparationaccordingtotheMW一、基本原理2-DEPrinciplesIEF(isoelectricfocusing)pI;isoelectricpoint:指蛋白质于特定pH值下该蛋白质的总静电荷为”零”时,称此时的pH值为此蛋白质之等电点。WhenpHpI→proteinisnegativecharge→movetoanodeFor

4、mationofpHgradientcarrierampholytes(载体两性电解质)加上highvoltage→pHgradient.缺点：pH梯度不稳定（阴极漂移），重复性差，上样量低。ResolutionforIEF:ImmobilizedpHgradients(IPG)：DevelopedbyBjellqvist(1982;BiochemBiophysMethods6:317)PHgradientarepreparedbyco-polymerizingacrylamidemonomerswithacrylamidederiva

5、tives(Immobilines)containingcarboxylicandtertiaryaminogroups.Immobilinesareweakacidorweakbase.immobilizedpHgradient,IPGThepHgradientisfixed,notaffectedbysamplecomposition.Reproducibledataarepresented.ModifiedbyAngelikaGorgbyusingthinfilmtosupportthethinpolyacrylamideIEFg

6、el,namedStrips.(1988,Electrophoresis,vol9,p531)IPGstripAdvantages:•mechanicallystrong•pHgradientcannotdrift•loadlargeramountofsample(dehydratedstrip)Disadvantages:•membrane/hydrophobicproteinspoorlyrepresentedon2D•somelargerproteinslost(sizeexclusion)SDSGelElectrophoresi

7、s二、基本流程Stepsin2DGE&PeptideID样品制备Isoelectricfocusing(firstdimension)SDS-PAGE(seconddimension)凝胶的染色凝胶的图像处理分析蛋白质的胶内酶切和质谱鉴定1.双向电泳分析中的样品制备基本原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白

8、，从而保证待研究蛋白的可检测性。样品制备的基本方法：细胞样品：反复冻融、超声破碎组织样品：碾磨、匀浆植物样品：碾磨分泌蛋白：蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白菌体蛋白：裂解液处理、超声破碎Interf