973蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究

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1、项目名称：肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究首席科学家：徐平中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：总后勤部卫生部二、预期目标1．总体目标本课题研究的总体目标是充分发挥我国在肝病模型、标本和肝脏蛋白质组研究方面的优势，利用定量蛋白质组学的原理和方法，对肝病发生发展过程中磷酸化、泛素化、糖基化蛋白质本身及其异质体的修饰位点、修饰类型、计量关系和动态变化规律以及控制机理进行系统研究。考察这些翻译后修饰在肝病病因、预后和治疗中的价值。通过本研究，我们将建立高效率

2、、低成本的蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化修饰和糖链结构解析的定性、定量研究技术；揭示肝病发生和癌变过程中磷酸化蛋白质信号通路的开关机制、泛素化调控的蛋白质量变引起质变的规律以及糖基化在肝癌发生发展和转移中的变化趋势，阐明这些翻译后修饰在肝病发生发展中的生理病理机制；筛选、鉴定一批具有诊断和药靶意义的肝病相关翻译后修饰蛋白或翻译后修饰调控蛋白。本项目的开展将加速我国定量疾病蛋白质组学研究体系的形成，培养一批从事蛋白质翻译后修饰研究的专门人才，产生一批具有国际影响力的论文和成果，继续保持我国肝病蛋白质组学研究基地在国际上的竞争优势。2．五年

3、目标1）发展一套高通量、高准确度和高精度的磷酸化、泛素化和糖基化蛋白质组的定性、定量研究技术及平台。2）系统比较在肝细胞癌发生发展过程中，HBx侵染宿主细胞后引起宿主细胞蛋白质磷酸化修饰进而导致HCC的分子机制，和肝细胞极性蛋白磷酸化修饰及其调控的下游蛋白磷酸化在肝细胞癌发生发展中的作用机制。阐明该过程信号途径和调控网络；发现肝病发展过程中磷酸化控制的关键蛋白；探索这些验证的关键蛋白作为药靶和肝病标志物的可能性。3）建立特定泛素链形成和脱泛素化的酶学决定机制和关系网络；筛选以Smurf1、NEDL1/2和SCF为代表的特异性泛素化蛋白

4、质；构建2个E3基因敲除小鼠模型，鉴定8-10个新的E3调控蛋白，揭示2-3类新的E3活性调控机制；获得2-3个在肝癌发生发展过程中发生显著变化的泛素连接酶，提供1个候选肝癌标志物。4）发展一套基于质谱数据的糖链结构计算机算法和聚糖结构解析芯片；建立肝病相关糖蛋白/核心岩藻糖化糖蛋白数据库；发现和鉴定100个与肝病相关的糖蛋白，10个有早诊和药靶意义的聚糖结构；解析2-3个糖蛋白聚糖的宏观和微观的不均一性与功能表达的关联和与肝病的联系；确认2－3种与肝病发生发展和转移密切相关的重要糖蛋白及其配基；阐明1-2个关键糖基转移酶家族成员表达

5、调控及在肝癌发生发展中的分子机制；探索差异调控1－2种蛋白质糖基化修饰的生物学机制。5）在国际核心刊物发表论文50篇以上，其中影响因子10以上的3-6篇；申请发明专利10项。6）造就一支蛋白质翻译后修饰高水平的科研队伍，培养国家杰青人才1名以上、培养博士和硕士研究生50-80人。三、研究方案1．学术思路本项目立足于我国重大肝病的国情，意图在原有肝脏蛋白质组学和大规模表达谱、翻译后修饰谱研究的基础上，选择研究基础好、与肝病发生发展和状态特征关系密切的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化展开研究。在改进基于质谱的磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白高通

6、量的定性和定量研究技术的基础上，结合已经建立的系列肝病相关的细胞、动物模型和临床标本，系统研究与肝病发生发展相关的蛋白质及其异质体的动态表达差异、调控规律和翻译后修饰信号识别的分子机制，进而揭示蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰与肝病关联的生理病理学意义。本研究项目需要蛋白质组学、生物信息学、遗传学、生物化学、基因组学、分析化学和糖生物学等各交叉学科团队的通力合作，而其产生的科研成果又将施惠于各个研究领域。2．技术途径本课题的技术途径包括肝病蛋白质及其翻译后修饰体差异的发现、差异相关的调控途径和网络研究以及重要功能蛋白的功能表征等3个层

7、面的多种途径。1）蛋白质及翻译后修饰体差异谱的产生技术：改进已有的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化鉴定、定量技术，结合我国在系列肝病模型和疾病标本方面的良好积累，利用代谢过程标记技术产生的重稳定性同位素完全标记蛋白质组为定量内标，进行多维LC-MS/MS或GeLC-MS/MS的蛋白质及其修饰异质体的定性鉴定和定量分析。对发现的差异利用可视化蛋白质及其修饰体差异显示技术等假阳性排除技术进行数据过滤，并用质谱多反应监测技术（MRM）进行验证。2）参与蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化调控的酶学机制和信号途径研究：利用基因敲除、基因敲入细胞株、肝病细

8、胞或小鼠模型，结合代谢过程标记的重稳定性同位素标记内标和基于MRM的翻译后修饰酶系目标导向定量蛋白质组技术，巧妙避开复杂蛋白质组样品和当前仍然有限的蛋白质组学鉴定能力之间的矛盾，定量比较、建立肝病相关翻译后修饰调控的信号