反相高效液相色谱报告ppt课件.ppt

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1、反相高效液相色谱（RP-HPLC)报告人：杨羚2高效液相色谱仪特点：高压、高效、高速、高灵敏高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。储液瓶手持控制器在线脱气机高压输液泵六通阀进样器柱温箱、色谱柱结构流程多肽/反相之间相互作用的吸附/脱附模型疏水部分与反相色谱柱的非极性基团吸附用RP-HPLC对固相合成的多肽进行纯化固态多肽（SPPS）合成的多肽的纯化，需要除去由不完全偶联、去保护或外消旋化、侧链重排或在去保护和SPPS步骤中引入多种化学物质引起的非目的的肽。一流动相的配制①分别配置1L的洗脱液A（弱流动相）和洗脱液B（强流动相）洗脱液A为

2、0.1%TFA水溶液洗脱液B为含0.09%TFA的60%乙腈水溶液②在容量瓶中用Teflon包被的磁力转子搅拌将溶液混合③用0.2umPTFE过滤器先过滤洗脱液A，然后过滤洗脱液B④洗脱液预脱气⑤用塞子塞进装有洗脱液的瓶子，避免有机溶剂挥发二肽样品的制备①先用终体积的一半的洗脱液A溶解样品以达到所需浓度。如样品不容易溶解，加入少量洗脱液B（＜25%总体积）②检验样品的纯度，如果含有不溶的固体颗粒，用0.2umPTFE过滤器过滤样品，或离心后取上清液。三RP-HPLC纯化固相合成的多肽(1)检测HPLC系统设备a用空白对照进样（进洗脱液A）并用与多肽

3、相同的洗脱梯度进行洗脱（100%A→100%B），如果出现“鬼峰”（假峰）就重复操作。b用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积(2)用RP-HPLC分析多肽粗制样a在正式分析样品之前，要现在同样条件下做一组空白对照。如果出现峰，则重复该步骤。b以分析型RPHPLC的程序分离粗制制样（约100ug）。c鉴定所要纯化的成分分析多肽粗制样spps步骤中所含有的少量化学杂质，会在后面230-280nm波长有非常强的吸收，所以这是一次预先分离，在214nm出检测。以确定主要的肽产物的保留时间，损失这几ug的样品。(3)准备RP-HPLCa按列出的实验条件，用制备型R

4、P-HPLC程序来分离粗制肽混合物（约25-100mg）b收集HPLC组分（3-7.5ml）（4）进行分析性RP-HPLCa用分析性RP-HPLC所收集的组分（30-50ul）进行分析。分别对空白对照、组织制样溶液、目标组分分析b通过比较纯化后成分的保留时间和粗制样中靶成分在色谱的保留时间，来确定收集到的含有在有效浓度范围内（>95%）目标蛋白的组分c将得到的多肽定量分装在微量离心管中，-20℃保存，用于进一步研究。（5）进一步分析a将95%以上的样品冻干b对最纯组分进行离线或在线电喷雾离子化质谱（ESI-MS）,以确定合成的肽或蛋白是否正确，或者

5、正确鉴定所要纯化的成分（HPLC）进行蛋白质的纯度检测及含量测定分子量测定：用HPLC测定几个分子量已知的蛋白质，绘制分子量与调整保留时间相对应的标准曲线，然后再在相同条件下测未知蛋白的保留时间，用标准曲线对照即可的未知蛋白的分子量；含量测定：用蛋白质标样配制一系列不同浓度的蛋白质溶液，绘制蛋白质浓度与峰高/峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高/峰面积，即可得未知样品的浓度；纯度测定：保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积/峰高除以所有峰峰面积/峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。实例分析主峰SPPS步骤裂解肽时加入的

6、清除剂，在254nm处有较强的吸收度这是制备型RPHPLC对合成多肽的进行的分离层析柱微粒10um，流速7.5ml/min，PH2.1，254nm这是分析型RPHPLC纯化固相合成产物层析柱微粒5um，流速1ml/min，PH2.1，214nm能获得较高纯度的终产物基础是在制备型RPHPLC中采用较缓的梯度，并收集较窄的峰组分。用RP-HPLC技术对多肽和蛋白质混合物进行脱盐在调节PH的时候，流动相中若使用非挥发性的盐，必须通过外加一步脱盐步骤使之从样品中去除。（注：TFA为挥发性盐）一、流动相配置。(1)配置缓冲液A（弱流动相）和缓冲液B（强流动

7、相）各1L缓冲液A(0.1％TFA水溶液)缓冲液B（0.09%TFA的2-丙醇溶液）(2)在备好的量筒中用Teflon包被的磁转子将溶液搅拌均匀（时间视体积而定）(3)用0.2umPTFE过滤器过滤缓冲液A和B.(4)将洗脱液瓶用塞子封闭，以防止有机溶剂挥发。二、多肽和蛋白质样品的制备(1)检查样品的纯度(2)如果存在不溶颗粒，用0.2umPTFE滤膜过滤，或者离心后取上清液三、用RP-HPLC进行蛋白质脱盐(1)检测HPLC系统a、进空白样(用洗脱液A进样)，先在100%洗脱液A中等梯度洗脱，再在100%洗脱液B中梯度洗脱，所有条件都与蛋白质样品

8、相同。b、用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积，从而确定洗脱时间。(2)蛋白质脱盐a将含盐样品注入反相柱中，用100%洗脱液A洗