反相高效液相色谱保留机理

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1、综述反相高效液相色谱保留机理—流动相的二次化学平衡作用殷芬（上海医科大学卫生分析化学教研室）使用化学键合有机固定相的反相高效液相色谱学平衡，能使大多数极性和离子性化合物在反相色RP—HPLC）已成为液相色谱中最重要的方法，谱中获得成功的分离[5-9]。调节流动相，以保持或在所有要进行分离分析的化合物中，有三分之二可改变溶质的浓度或存在的形式，因而控制溶质在流用RP—HPLC来完成[1-4]。动相和固定相之间的分配。目前大多数研究工作都反相液相色谱最初是用来分离非极性和非离子是涉及到离子平衡（如溶质的离子化

2、控制和形成离型化合物的。随着研究的不断深入，实践证明，将子对）。此外，除对保留和选择性进行控制外，还流动相的组分进行调节，往水溶性流动相中加入适可靠抑制干扰竞争平衡或副反应来改善峰形，图1当的缓冲液或有机改性剂，即控制流动相的二次化表明了中性和离子化合物在反相柱上的保留范围。性和碱性药物进行分析。其实验结果证实，流动相一、缓冲液的使用及离子抑制的pH值以及化合物本身的pKa值对保留性质有很大量实验结果证实，对弱酸、弱碱这些在水溶大影响，并认为化合物在ODS反相柱系统中的分性溶液中易发生离子化的样品进行分离

3、时，最简便配主要取决于三个物理化学性质：的方法就是用缓冲液来调节流动相的pH值[10,11],1．化合物以非离子（化）形式存在的比例亦即对离子化过程进行抑制，所以此方法被称为（即流动相pH值及化合物pKa的函数）。“离子抑制”(lonSuppress)，且离子抑制最有效2．化合物的非离子（化）形式在固定相和流的范围是在pH3—8[5]。动相中的相对脂溶性（即化合物在水和有机溶剂间Twitchett和Moffat[12]在BondapakC1柱的分配系数）。上用甲醇和各种不同PH值的磷酸缓冲液混合组成3.流

4、动相中甲醇的比例。流动相。选择了三十种有代表性的强酸、弱酸、中正如所料，化合物的非离子化形式易分配进入固定相。因此，当化合物的pKa和分配系数已知时，可对其色谱性质进行推测。二、离子对色谱此外，缓冲盐的种类对化合物的保留也有影离子对技术在很多情况下可代替离子交换用于响。有实验发现[13]，在流动相中用派嗪或磷酸四分离离子化合物。此方法现已能够对大量化合物亚甲基二胺代替磷酸钠作缓冲液时。同样是将流动（包括生物胺、药物及其代谢物、染料、羧酸等）相pH调至6，而被分离物的保留性质有明显改变，进行有效分离[20-

5、24]。现代离子对液体色谱可归为峰形改善。Popl等[14]也进行了这方面的研究，用几类：1．正相离子对分配色谱，将会有离子对试剂甲醇:水（70:30）的流动相，缓冲液浓度和PH值保的水溶液涂布在硅胶上，用有机溶剂流动相洗脱化持不变，用醋酸铵代替磷酸二氢钠时，生物碱的保合物；2．反相离子对分配色谱，固定相为非极性表留因子减小。这说明，除有维持溶液pH值的作用面（如C8或C18），分离酸时在水溶性流动相中加外，缓冲液还有多种作用，这些还有待于进一步探入有机碱（如磷酸四丁铵），分离碱时可加入有机讨研究。酸（如

6、辛基磺酸）。由于ODS柱的化学不稳定性，在pH1.5—8范因为用离子交换法分离中性和离子样品时并非围之外，固定相会发生降解，所以对pKa小于2或都令人满意，而用离子抑制法分离离子化合物也有大于7的化合物就不适宜用缓冲液来抑制离子化。困难，所以反相离子对色谱已广泛用于分离带不同但近年来HPLC迅速发展，使用化学性质更为惰电荷的化合物。性的大孔聚合物（苯乙烯—二乙烯苯）固定离子对色谱的保留机理一直难以确定。目前有相[15-17]，使得流动相使用的PH范围达到1—13,三种假设，其中的两种提出了较极端的情形，而

7、且因而离子选择性的优点也可用于强酸和强碱的分各自都包罗了数量可观的色谱数据，它们分别是离离，这方面已有报道[18]。子对模式和动力学离子交换模式，第三种观点则是关于离子抑制的机理还未确切了解，目前认为离子相互作用机理。有两个主要原因[5]，第一，认为流动相中的缓冲离子对机理强调，被分离化合物与流动相中的液与被分析样品相互反应，使得样品的离子平衡向相反离子形成离子对，然后这一不带电荷的离子对“中性”形式移动，这就易于在反相柱上进行色谱分配进入亲脂性固定相中[25-27]，用方程式描述分配。例如，根据下列平衡

8、存在的离子化合物：此过程：RCOOH+H2O≒RCOO-+HO+Raq++Caq-[RC]aq[RC]rg非离子离子图2为离子对机理的示意图。用缓冲液调节色谱系统的pH，提供更多的质子而促使平衡向左移动。当PH值低于某弱酸的PKa时，则其保留时间就长（抑制了离子化），反之，当pH值高于PKS时，洗脱就快；碱性样品正好相反。PH值高于PKa，保留时间则长PH值低于pKa，洗脱就快。之所以样品的离子形式比中性形式洗脱较快是因为离子