蛋白质的反相液相色谱保留方程研究.pdf

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1、第41卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第2期2013年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry181～186DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20881蛋白质的反相液相色谱保留方程研究丁玲董军肖远胜张秀莉薛兴亚梁鑫淼(中国科学院大连化学物理研究所，大连116023)摘要要以胰岛素、细胞色素C、溶菌酶、转铁蛋白和肌红蛋白5种标准蛋白为研究对象，将6种浓度的标准蛋白在反相色谱(WatersSymmetry300C4、WatersSymmetry300Cl8、C8H

2、C)的保留时间非线性拟合(CSASS软件)，获得了5种蛋白质在3种色谱柱的Ink=a+cC方程，15个方程的回归系数均大于0．999，证实方程Ink=a+cCs可准确地描述蛋白质在反相色谱的保留规律。运用该方程可预测蛋白质在其它梯度条件下的保留时间，预测值和实验值的相对误差均小于5％。该方程还可用于蛋白质混合物的梯度分离的优化，20min内可实现5种标准蛋白的基线分离。关键词蛋白质；反相色谱；保留方程；预测；优化1引言蛋白质是生物有机体的重要组成部分，它在生命活动的各个环节(如新陈代谢、神经传导、遗传和繁殖过程)中起着重要作

3、用。同时，蛋白质在食品、药品、医学诊断和生物催化领域也有广泛应用。蛋白质是现代科学研究的热点之一。大规模高效分离制备蛋白质，对基础研究及工业生产都具有重要意义。蛋白质的色谱分离方法主要包括离子交换色谱(IEC)、体积排阻色谱(SEC)]、亲和色谱(AFC)朋、疏水作用色谱(HIC)和反相高效液相色谱(RPLC)等。RPLC与其它几种分离方法相比具有很多优势：分离效率高、重现性好、操作简单，使用挥发性流动相，免去了脱盐的繁琐步骤，还可以与质谱技术联用，因此，RPLC已成为一种重要的蛋白质分离纯化技术。然而蛋白质的反相分离经常存

4、在一些问题。蛋白质的分子量较大，空间结构复杂，与固定相、流动相及其它溶质之间存在多种相互作用，易造成谱带扩散、拖尾等问题。另外，蛋白质与小分子化合物相比有着不同的保留行为。以往研究发现，流动相中有机相浓度的微小变化都会对蛋白质的保留产生较大的影响[1引，一旦有机相达到一定浓度，分子会立即洗脱，这个机理也被称为“on—of'’机制[1钔。实际分离时，不同蛋白质的特性不同，选择合适的洗脱条件有一定困难。因此，研究蛋白质的反相色谱保留规律并用于优化分离条件是非常重要的。目前，对于色谱保留规律的描述有很多模型，如定量结构保留关系(Q

5、SRR)、人工神经元网络(ANN)、计量置换理论(SDT．R)及线性溶剂强度模型(LSS)踟等。这些模型可以准确描述给定溶质的色谱保留行为，但是它们的参数较多且复杂，为了获取参数，需要知道溶质的结构信息或者进行复杂的实验，所以在实际分离中应用这些模型来优化蛋白质分离条件存在一定的局限性。邹汉法等[1等提出的顶替吸附．相互作用模型，既考虑了溶质和溶剂在固定相表面的竞争顶替吸附效应，又充分考虑到了溶剂和溶质的相互作用，是一个较合理的液相色谱保留过程的物理化学模型。该模型的表达式参数少，形式简单，只需进行几次不同的梯度实验即可计算

6、出保留参数值，很适合实际分离过程的梯度条件优化。目前，顶替吸附一相互作用模型可以很好地描述小分子化合物在反相色谱的保留行为，实现保留时间的准确预测[1们，但是用该模型描述蛋白质反相色谱保留行为的研究甚少。本研究以标准蛋白为研究对象，将6种浓度的标准蛋白在反相色谱的保留时间非线性拟合，得到各蛋白的保留参数值，验证了顶替吸附一相互作用模型能够准确的描述大分子蛋白质在反相色谱的保留行为，实现了任意梯度下保留时间的预测，以达到快速准确地优化蛋白质反相色谱分离条件的目的。2012-08-31收稿；2012—10．15接受本文系国家重点

7、基础研究发展计划(No2012CB910601)和“十二五”国家科技支撑计划项目(No2012BAD33B03)资助E—mail：liangxm@dicp．ac．ca182分析化学第41卷2实验部分2．1材料与试剂乙腈(色谱纯，Fisher公司)；实验用水~Milli—Q超纯水净化系统过滤，三氟乙酸(Tedia公司)。蛋白质标准品胰岛素(Ins，bovine表15种标准蛋白质的信息pancreas)、溶菌酶(Lys，Table1Informationoffivestandardproteinschickeneggwhite)

8、、细胞色素C(CytC，bovineheart)、转铁蛋白(Tf,bovine)、肌红蛋白(Mb，equineskeletalmuscle)均购于Sigma—Aldrich公司，5种标准蛋白的信息见表1。所有蛋白质保存于0℃，色谱分析前，用0．1％TFA溶液配制成每种蛋白浓度为02g／L的