反相液相色谱鬼峰来源.pdf

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1、反相液相色谱鬼峰来源2016-07-26作者：BruceLee来源：药渡网1.概述在反相液相色谱分析方法开发过程中，采用等度洗脱时，先洗脱组分的色谱峰峰宽较窄，后洗脱组分的色谱峰峰宽较宽；而梯度洗脱方式，则具有分析时间短(特别是对于样品组分复杂的情况来说)，在梯度范围内各色谱峰的峰宽近乎一致等特点。梯度洗脱时色谱峰纵向扩展可控特点，可参考下图1进行理解。基质或者样品组分比较复杂时，梯度洗脱是反相液相色谱最常用的操作模式，而主要在梯度洗脱中出现的鬼峰是特别让人头疼的。有可能由于来源排查不清以及解决方案不到位而导致原来的方法在实际的应用与转移过程中出现问题，甚至面临重新开发方法

2、的尴尬境地。鬼峰意即来源不清，不可指认，时有时无，对目标峰或者样品纯度测试产生干扰作用的峰，如下图2所示，即为典型的鬼峰，一般来讲，鬼峰的出现与色谱柱无关(当然，梯度洗脱时，梯度设置不合适的情况除外)。对于含量或者纯度检测方法而言，在主峰位置或附近出现鬼峰的话，影响到方法的专属性以及检测结果准确性(如下图3)。特别地，对于药物制剂或者API的纯度测试来说，要求对降解产生的杂质之外的杂质来源做出较详细的说明(如反应副产物或者反应原料带入等)。鬼峰的出现，可能增加此项工作的难度与工作量。此外，鬼峰需要与梯度洗脱时由于梯度的突然变化引起的梯度峰进行区分，如下图4所示，在20min

3、处由于梯度的陡然变化，造成流动相组成的急剧改变引起流动相折光特性发生很大的变化，而出现梯度峰(其峰形与所定的检测波长有关)。在梯度洗脱模式下，可以通过避免突然大范围改变流动相的组成来避免尖锐的梯度峰的出现，同时也有助于减少泵的故障率。2.鬼峰来源与解决方案鬼峰来源多种多样，理论上讲，在HPLC系统中任何一个节点均有可能引入鬼峰，依据鬼峰出现的频率，其主要来源于流动相部分，样品制备以及自动进样部分，仪器流路及检测器部分等，如下图5所示。2.1仪器流路及检测器引起的鬼峰仪器流路中的残留气泡可以引起鬼峰，保留时间一般不可重现，即使流路中气泡连续存在，鬼峰出现的位置亦不可预测。可将

4、流动相超声或鼓He脱除气泡并打开purge阀，大流速冲出仪器管路中的气泡，来减少气泡引起的鬼峰现象。由泵的混合或者泵的突然切换引入的鬼峰一般发生在梯度峰及其之后位置，在低压混合模式下出现的可能性更大。实际应用中(无论是高压混合模式还是低压混合模式)，梯度峰之后经常是不被关注的地方，如下图6。同一台仪器，可通过进样Blank或检查紫外吸收光谱，确认其是否为鬼峰。在不影响分析方法目的以及对结果判断的情况下，可不用对此过于纠结。检测器处引入的鬼峰，多为一些样品组分在检测器流通池内的残留，其特点具有先后针之间的重复性差，或者没有重复性，色谱峰峰形特别尖锐类似大的毛刺。该种情形下，需

5、要对流通池特别是石英视窗进行彻底清洗(联系工程师或者严格按照manual进行)。混合器本身有时也会引入鬼峰，如下图所示同样的流动相，在系统流路的不同位置(分别为混合器前面与后面)添加污染物捕集装置，对基线进行监测如下图7所示。从图中可以明确看出混合器由于被污染而在色谱图上引入了鬼峰。此外，同一台仪器经常在不同的流动相体系之间进行切换的时候，特别需要注意整个仪器管路内的污染物残留。当怀疑仪器流路内壁被残留物污染时，可用水：乙腈：异丙醇：甲醇=1：1：1：1的比例，以1mL/min的流速冲洗整个流路2h以上，可将流路内的污染物残留冲洗完全。2.2样品制备以及自动进样引入的鬼峰由

6、样品制备引入的鬼峰，多集中与使用了不干净被污染的溶剂或者不干净的进样小瓶(如下图8)。这种情况下的鬼峰，容易排除，仅需要分别将样品溶解或稀释用的试剂以及进样小瓶更换，即可确定鬼峰的来源。此外，由自动进样器引入的鬼峰，也不在少数。自动进样器进样的流程(如下图9)所示。在进样之后，部分样品溶液残留在进样针头以及针座之上，对下次进样别的样品的结果产生干扰，出现鬼峰。对于一些强吸附性组分，尽管进行程序洗针，有时依然可能会引入鬼峰。针对这种情形，可在仪器平衡之后，分别进样不同试剂的Blank以及不进样，比较得到的图谱，基本可确定鬼峰是否来源于进样过程。2.3流动相引入的鬼峰在实际的应

7、用中，鬼峰最主要来源为流动相，包括水相，有机相，有机酸碱添加剂，缓冲盐以及流动相瓶等，(如下图10)所示。其中水相引入的鬼峰是最常见的，水中含有的有机，无机杂质均有可能对检测结果产生干扰，出现鬼峰。水相引入鬼峰的可能原因有：水中本来含有的有机，无机杂质；水相在使用过程中有尘埃或者空气中的有机物落入或溶解进去；水相在存放或使用的过程中，细菌等微生物滋生等。有机相如甲醇，乙腈，四氢呋喃等，亦有可能引入鬼峰(如上图10所示)。有机相引入的鬼峰，原因多为有机相使用完之后未更换新的流动相瓶，而是直接添加补充的方式；以及流动相