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1、第三章免疫原和抗血清的制备抗原和抗体是免疫学检测的两个重要因素,也是整个免疫反应的基本条件第一节免疫原的制备免疫原是诱导机体产生抗体和致敏淋巴细胞,并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。在制备抗体的过程中,合格的免疫原是制备高质量抗体的重要保障。一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原。绵羊红细胞、细菌、毒素、寄生虫和真菌抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、酶、补体和核酸等都是良好的可溶性抗原。（一）组织和细
2、胞粗抗原的制备1.组织细胞抗原的制备所用组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或者组织处理粉碎高速组织捣碎机研磨法离心3000r/min，10分钟沉淀上清1万—2万转/分，20到30分钟上清液中含有可溶性抗原2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备制备抗原的细胞包括正常细胞、传代细胞或病理细胞(如肿瘤细胞)。(1)反复冻融法；(2)超声破碎法；(3)自溶法；(4)酶处理法；(5)表面活性剂处理法。(二)超速离心分离法超速离心分离法最常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白质用超速离心或梯度密度离心分离和纯化抗原只是
3、一种根据抗原的比重特点分离的方法,除个别成分外,极难将某一抗原成分分离出来。（三）选择性沉淀法1.核酸去除法：用沉淀剂或者核酸酶2.盐析沉淀法：该方法是最经典的蛋白质纯化分离技术。用于抗原的粗筛、提取丙种球蛋白和抗原的浓缩。有机溶剂沉淀法水溶性非离子型聚合物沉淀法(四)凝胶过滤凝胶过滤又名分子筛层析，凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经过处理平衡后，装入层析柱内成为分子筛的支撑物。(五)离子交换层析离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附交换带有相反电荷的蛋白质抗原。离子交换层析技术
4、中常用的离子交换剂有四种:①具有离子交换基团的纤维素,常称离子交换纤维素;②具有离子交换基团的交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺;③被覆以离子化物质的细粉;④凝胶合成的高度交联树脂。（六）亲和层析亲和层析是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。例如抗原和抗体、酶和酶抑制剂、酶蛋白和辅酶、DNA和RNA、激素和受体等之间有特殊的亲和力,在一定的条件下,二者能紧密地结合成复合物。如果将复合物的已知一方固定在固相载体上,则可从溶液中专一性地分离和提纯另一方。(七)免疫球
5、蛋白片段的制备1.温和条件离析亚单位：可用两种方法将其断开制备片段。第一种方法为改变pH；第二种方法是利用强变性剂将亚单位分开。2.二硫键的解离：二硫键是连接免疫球蛋白肽链的共价键,解离二硫键后可将重链和轻链分开解离的方法多采用还原法或氧化法。3.溴化氰裂解法：溴化氰与蛋白质中的甲硫氨酸侧链硫醚基起反应后,生成溴化亚氨内酯,再与水反应,将肽链断裂。4.酶裂解法(八)纯化抗原的鉴定纯化抗原的鉴定一般包括含量鉴定、理化性质鉴定、纯度鉴定和免疫活性鉴定等。三、半抗原性免疫原的制备只有把半抗原与蛋白质载体或与
6、高分子聚合物结合后,才能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞。（一）载体的选择载体有蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒等。(二)半抗原-载体连接方法半抗原与载体连接必须掌握三个基本条件:①带游离氨基或游离羧基以及两种基团都有的半抗原；②带有羟基、酮基和醛基的半抗原,不能直接与载体连接,需要用化学方法在半抗原上引进羧基后才能与载体连接；③芳香族半抗原由于环上带有羧基,它邻位上的氢很活泼,极易取代。半抗原结合到载体上的数目与免疫原性有关。一般认为应连接20个以上的半抗原,才能有效地产生抗体。因此当
7、结合完成后,应测量半抗原与载体的比例。第二节免疫佐剂免疫佐剂(immunoadjuvant)是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。一、佐剂的种类1.具有免疫原性的佐剂如卡介苗、枯草分支杆菌、短小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素(脂多糖)和细胞因子等。2.非免疫原性佐剂如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核昔酸和胞壁肽等。1.福氏佐剂(Freundadjuvant,FA)是目前动物免疫中最常应用的佐剂,
8、可分为福氏不完全佐剂(石蜡油+羊毛脂)和福氏完全佐剂(石蜡油+羊毛脂+卡介苗)两种。2.细胞因子佐剂细胞因子佐剂与抗原合用,可以更有效地激发机体的免疫功能,增强免疫反应。二、佐剂的免疫生物学作用1.增强免疫原性使弱免疫原性物质变成持久或强的免疫原。2.增加抗体的滴度可提高机体初次和再次免疫应答的抗体滴度。3.引起或增强迟发型超敏反应由于佐剂作用引起过强的免疫应答而导致的病理生理反应。三、佐剂增强免疫应答的机制1.改变抗原物理性状,使抗原在体内滞留或缓慢释
