免疫原和抗血清的制备.ppt

《免疫原和抗血清的制备.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反应的物质一、颗粒性抗原的制备：1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。2.细菌抗原：H抗原　有动力的菌株O抗原100℃2-2.5h为了破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较少用佐剂作皮内注射二、可溶性抗原的制备：组织和细胞粗抗原的制备：1.组织和细胞混合抗原的制备：　组织匀浆制备：　标本要求：新鲜或低温（＜-40℃）保存的去除表面包膜或结缔组织或一些大血管，脏器应进行  灌注，除去血管内残留血液制备处理好组织→0.05％Na

2、N3生理盐水洗净→剪成小块　粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000rpm离心10min研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨→上清10000-20000rpm20-30min高速离心2.细胞抗原的制备：细胞抗原　细胞膜蛋白抗原　　　　　细胞浆抗原　　　　　细胞核及核膜抗原粉碎：　　（1）反复冻融法　　（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸　　（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏　　（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系　　　　需一定PH和温度动物组织cell0-4℃微生物　　　　室温　　（

3、5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛酶，纤维素酶消化细菌和组织cell（6）表面活性剂处理法蛋白质抗原的制备和纯化：可溶性抗原绝大部分为蛋白质1.超速离心和梯度密度离心法：用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高，即所谓梯度3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋白质抗原不适用此

4、法2.选择性沉淀法：用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀1）核酸除去法：　　　　　　　（1）提取沉淀剂：　　　　　　　（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液作用30-60min（4℃），即可除去核酸2）盐析沉淀法：　　　　　　　（1）抗原的粗筛33-50％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（2）提取丙种球蛋白　　主要为IgG33-40％饱和度的硫酸铵　　　　　　　（3）抗原的浓缩3）有机溶剂沉淀法：　　　　　　　有机溶剂多为酒精和丙酮4）水溶性非离子型聚合物沉淀法：PEG+蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的重分配分子量

5、2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同pro3-4％沉淀免疫复合物6-7％沉淀IgM8-12％沉淀IgG12-15%沉淀其他球蛋白25％沉淀白蛋白3.凝胶过滤和离子交换层析：1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种　　　　　　大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分子量不同2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素　　　　　　流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）　　　　　　根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同）　　　　　　常用于分离

6、IgM因为IgM分子量大　　　　　　凝胶过滤洗脱曲线4.亲和层析：利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲和力，可紧密结合成复合物.1）亲和层析支持物的选择：　　　常用：琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）2）配体的选择：3）抗原或抗体与支持物的结合：　　　步骤：　（1）活化支持物上的功能基因　　　溴化氛PH11与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因　（2）交联（联接）　（3）清洗：除去未结合的pr

7、o（4）亲和层析条件的选择：原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。2）配体的选择：抗原或抗体与支持物的结合：　　步骤

8、：　（1）活化支持物上的功能基团溴化氰PH11与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团　（2）交联（联接）　（3）清洗：除去未结合的pro（4）亲和层