免疫原和抗血清的制备多媒体.ppt

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1、第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备一、颗粒性抗原的制备二、可溶性抗原的制备和纯化三、半抗原性免疫原的制备第二节免疫佐剂一、佐剂的种类二、佐剂的作用机制第三节抗血清的制备一、免疫动物的选择二、免疫程序三、动物采血法第四节抗血清的鉴定和保存一、抗血清的鉴定二、抗血清的保存第五节抗血清的纯化一、特异性IgG抗体二、单价特异性抗血清思考题小结基本要求：掌握：免疫原、抗血清的制备过程。掌握：抗血清的鉴定方法、抗血清的纯化方法抗原抗体是免疫学检测的重要因素。抗原纯化是制备特异性抗体的先决条件。制备高效价高特异性的抗血

2、清必须有理想的免疫原。通过抗血清的制备而获得特异性的抗体可用于纯化抗原和检测或鉴定抗原。抗体有来自单克隆抗体、免疫动物的多克隆抗体和基因工程的抗体。第一节免疫原的制备免疫原(immunogen)是能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。颗粒性抗原－细胞、细菌、寄生虫可溶性抗原－蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸细胞抗原：绵羊红细胞细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原寄生虫体抗原：虫卵一、颗粒性抗原的制备颗粒性抗原的制备颗粒性抗原包括人和各种动物细胞抗原以及各种细菌抗原和寄生虫体抗原

3、。细胞抗原：（绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水洗净，配制一定浓度的细胞悬液，即可应用。免疫原的制备细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。鞭毛抗原需用0．3%~0．5%的甲醛处理；菌体抗原加温100℃2~2．5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0．5%~1．0%氯化钙溶液等。颗粒抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。蛋白质、糖蛋白、细菌毒素、酶、补体和核酸都是良好的可溶性抗原。这些蛋白质多为复杂的蛋白组成，免疫前需进行纯化。二、可溶性抗原的制备和纯化组织细胞抗原的制备：高速捣碎法－组织捣碎机捣碎

4、研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨（一）二、可溶性抗原的制备和纯化高速组织捣碎机法：将组织加盐水装入捣碎机筒内，间断进行离心，每次30到60分钟，时间过长会导致产热。研磨法：用玻璃均浆器或乳钵研磨，经过旋转、压挤将组织粉碎。组织均浆液要离心沉淀，沉淀物组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。二、可溶性抗原的制备和纯化组织细胞或培养细胞可溶性抗原的制备制备抗原的细胞包括正常的细胞、传代细胞或肿瘤细胞。细胞抗原一般分为三个部分：膜蛋白抗原、细胞质抗原（细胞器）和细胞核与核膜抗原。二、可溶性抗原的制备和纯化组织细胞或培

5、养细胞可溶性抗原的制备：反复冻融法－-20℃冻结，然后室温融化超声破碎法－超声波（1～20kHz）自溶法－自身酶系酶处理法－溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶表面活性剂处理法－SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴反复冷冻法：将细胞或整块组织置-20℃冰箱内冻结，然后置室温融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可冻融破碎。超声破碎法：利用超声波机械振动的原理使细胞破碎。常用于处理微生物和组织的细胞。自溶法：利用组织和微生物的自身酶系统，在一定PH和温度下，使其细胞裂解。酶处理法：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等，在一定的条

6、件下能消化细菌和组织细胞。表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。超速离心法：差速离心法－低速和高速离心交替进行密度梯度离心法－区带离心法（二）可溶性抗原的纯化超速离心分离法常用于分离亚细胞成分及大分子蛋白。差速离心法：用于分离大小差异较大的抗原颗粒梯度密度离心法：区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒分离。（梯度柱）。选择性沉淀法：核酸去除法－氯化锰、硫酸鱼精蛋白、链霉素盐析法－硫酸铵、硫酸钠有机溶剂沉淀法－乙醇、丙酮聚合物沉淀法－聚乙二醇选择沉淀法采用各种沉淀剂或某些条件促使抗原成分沉淀

7、的方法。核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简单（采用DNA或RNA酶）有机溶剂沉淀法：使用的有机溶剂多为乙醇或丙酮。选择沉淀法盐析沉淀法经典的蛋白质纯化分离技术抗原的初筛：用不同饱和度的硫酸钠或硫酸铵使蛋白抗原进行初筛。提取丙种球蛋白:（IgG95%以上）将33%~50%饱和度硫酸胺沉淀物经去盐后可直接用于抗体试剂。抗原的浓缩：通过加入硫酸铵，将其沉淀下来，以利于进一步纯化。离子交换层析法：利用蛋白质带电荷不同进行分离离子交换剂：离子交换纤维素、离子交换凝胶、离子交换树脂凝胶

8、过滤法：利用凝胶的分子筛作用，对分子量不同的蛋白质进行分离凝胶过滤分子筛层析，具有三维空间多孔网状结构的物质。将含多种分子量的样品溶液缓慢流经凝胶柱时，各分子在柱内进行两种不同运动，垂直向下移动和无定向扩散运动。通过凝胶分子筛作用，大、中、小三类分子彼此较易分开。离子交换层析离子交换层析是利用一些带电离子集团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。1、