免疫原和抗血清制备技术

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1、免疫原和抗血清制备技术第一节免疫原的制备第二节免疫血清的制备第三节抗体的纯化和鉴定第一节免疫原的制备一、细胞性抗原的制备二、可溶性抗原制备及鉴定三、半抗原免疫原的制备四、佐剂绵羊红细胞的制备流程图摇动15-20min4℃可保存3周取适量NS洗涤3次2000r/min10minNS稀释至2～5%细菌细胞抗原的制备流程图液体培养或斜面培养37℃24h100℃水浴2～2.5h杀菌无菌试验NS稀释成8～10亿/mlO菌体抗原返回来源:组织和细胞，其成分比较复杂。1.组织和细胞成分混合抗原制备2.蛋白质抗原制备3.核酸抗原制备4.类脂多糖抗原制备5.免疫球蛋白片段制备6.纯化

2、抗原的鉴定二、可溶性抗原制备及鉴定可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸二、可溶性抗原制备及鉴定返回组织和细胞成分混合抗原制备程序上清液澄清所用材料必须是新鲜或低温保存的去除包膜或结缔组织脏器进行灌洗洗去血迹及污物NS内含0.5g／LNaN2冷浴中组织剪碎装入捣碎机简内高速粉碎制成组织匀浆液3000r／min×10min取上清液去除细胞碎片及微小组织离心细胞破碎技术及评价1.酶处理法2.冻融法3.超声破碎法4.表面活性剂处理细胞破碎技术及评价常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等1.酶处理法1.酶处理法方法：在一定的条件下，能消化细菌

3、和组织细胞。特点：①此法适用多种微生物；②具有作用条件温和；③内含物成分不易受到破坏；④细胞壁损坏的程度可以控制。2.冻融法原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。2.冻融法完方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。特点：此法适用于组织细胞，对微生物细胞作用较差。3.超声破碎法原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。由于超声波发生空化作用（cavitation）使得液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz～

4、20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。3.超声破碎法特点：①操作简单，重复性较好，节省时间；②多用于微生物和组织细胞的破碎。4.表面活性剂处理原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使膜的渗透性改变或使之溶解。4.表面活性剂处理常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯（非离子型）、新洁尔灭等。应用：①破碎细菌，且作用比较温和；②提取核酸时，常用此法破碎细胞。蛋白质抗原制备蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的抗血清通常需要纯化。可采用：1.超速离心法2.选择性沉淀法3.

5、凝胶层析法4.离子交换层析法5.亲合层析法蛋白质抗原制备1．超速离心法原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。1．超速离心法特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗原，极难将某一抗原成分分离出来。应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。2、选择性沉淀法原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。2、选择性沉淀法常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解度不同）；常用33～50％

6、饱和度的硫酸胺。特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。3．凝胶层析法（凝胶过滤法）原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。3．凝胶层析法（凝胶过滤法）4．离子交换层析法原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷

7、不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使血清中的蛋白质分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。4．离子交换层析法5．亲和层析法（亲和色谱）原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。5．