逆转录酶活性荧光定量检测报告单.doc

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1、血浆逆转录酶活性荧光定量检测项目科研结果报告单医院：科室：实验样本：人血液标本实验名称：血液逆转录酶活性荧光定量检测1、实验试剂：EnzChek®ReverseTranscriptaseAssayKit(MolecularProbes,E-22064)；逆转录酶稀释缓冲液：50mMTris-HCl,20%glycerol,2mMDTT,pH7.6；无核酸酶水2、实验仪器：SpectraMax®i3多功能酶标仪(MolecularDevices)eppendorf5430R冷冻高速离心机海尔DW-40L262医用低温保存

2、箱96孔黑色酶标板（WHB-96）3、实验步骤：1）血浆样品准备①将置于抗凝管里的血液放进4℃离心机离心10分钟，速度为700g；②小心地移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分；③血浆即刻分装，一部分置于冰槽里备用，剩余部分放进－80℃冰箱里保存。2）准备反应混合液①100个反应：10μl体系（孵育1h）成分D（Poly(A)ribonucleotidetemplate）5μL成分E（Oligod(T)16primer）5μL10μL混匀，室温孵育1h，使引物与模板配对。②反应混合液：用成分F（Poly

3、merizationbuffer）200倍稀释步骤1中的引物/模板混合液，即把10μL引物/模板混合液加入到2.0mL成分F中。③分装：根据样品数，分别取20μL反应混合液到96孔黑色酶标板中。3）制作λDNA标准曲线及测定待测样品①准备逆转录酶稀释缓冲液利用合适的缓冲液稀释逆转录酶，如50mMTris-HCl,20%glycerol,2mMDTT,pH7.6。②λDNA浓度梯度稀释：用逆转录酶稀释缓冲液稀释成分C（100μg/mLλDNA溶液），从40ng/mL到4μg/mL。01234567100μg/mLλDNA

4、溶液00.4μL4μL8μL16μL24μL32μL40μL逆转录酶稀释缓冲液1000μL999.6μL996μL992μL984μL976μL968μL960μLλDNA浓度040ng/mL400ng/mL800ng/mL1600ng/mL2400ng/mL3200ng/mL4000ng/mL③反应体系：取5μLλDNA稀释液（或者5μL待测样品）加入到已准备好的20μL反应混合液中。（包含1个不含酶的稀释缓冲液作为空白对照）④运行反应：在25度反应10-60分钟。⑤终止反应：往每个反应中加入2μL的成分G（200m

5、MEDTA），将样品液保存在4度直至测定吸光值。⑥往已经终止的每个反应液中加入173μLPicoGreen工作液。室温孵育2-5分钟，注意避光。⑦测荧光：（尽量保证所有样品在同样的时间内检测）激发光：480nm，发射光：520nm⑧读取荧光值，制作标准曲线并根据标准曲线方程获得待测样品对应DNA浓度。荧光强度值=样品荧光强度值-对照荧光强度值01234567待测样品反应体系20μL反应混合液5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL5μL运行反应25度反应10-60分钟终止反应2μL的成分G（200mMEDTA）

6、将样品液保存在4度直至测定吸光值加入173μLPicoGreen工作液λDNA终浓度01ng/mL10ng/mL20ng/mL40ng/mL60ng/mL80ng/mL100ng/mLX值ng/mL室温孵育2-5分钟，注意避光测荧光激发光：480nm，发射光：520nm3、实验结果：1）制作λDNA标准曲线详细结果见附件1：λDNA标准曲线2）测定的待测样品结果详细结果见附件2：待测样品的结果结果说明：根据试剂盒的检测原理，此结果为在一定的反应时间内（如25度60分钟），通过5μL待测样品中逆转录酶的催化，聚合产生RN

7、A-DNA异源双链分子相当于λDNA的量。附件1：λDNA标准曲线编号01234567λDNA终浓度ng/mL011020406080100荧光值制作标准曲线：标准曲线方程为：y=.6103x+.1487（R²=0.9956）附件2：待测样品的结果结果如下：（X值：根据标准曲线方程获得待测样品对应λDNA终浓度）姓名样品编号荧光值X值ng/mL逆转录酶活性U/ml对照情况正常对照110.789433.877/210.082464.282/310.135447.238/411.292441.675/511.468469.

8、701/613.841447.585/平均值11.268450.726/艾盟119.004815.08280.84%陈玫213.903556.10523.38%李忠军312.031517.83814.89%欧阳明燕413.076559.65324.17%陈辉杰519.820792.80075.89%彭玲玲612.632512.79