荧光定量PCR技术.doc

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1、荧光定量PCR技术本文作者屈晓超女士，西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室，生命科学与技术学院生物医学工稈研究所硕士研究生；关键词：聚合酶链式反应(PCR)荧光定量PCR(FQ-PCR)引言核酸研究已冇100多年的历史。本世纪60年代末70年代初，人们开始致力于研究基因的体外分离技术。1971年，Korana最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程，便可克隆tRNA基因”。PCR基本原理示意图Cr值的确立张镇西先生，博士、生命科学与技术学院副院长、教授、博士生导师。P

2、CR技术的发明人为KaryMullis。他于1983年在一家生物高技术公司(Cetus)的人类遗传研究室工作。该研究室的主要任务是为公司的其他实验室合成寡核昔酸。当时有一种方法称为"DNA印迹法”，能够鉴定和比较DNA片段的长度，但是此方法步骤繁琐，时间周期长，还有放射性，Mullis很不喜欢这种方法。他着手用简单的方法鉴定DNA片段。经过—-段时间的摸索，Mullis及同事于1985年成功地研制了PCR技术。此方法在分子生物科学家中也引起了链式反应。大家纷纷采用这个方法。在短短的几年内，PCR迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广

3、泛应用，被许多科学家视为近十年来，分子生物学领域最重要的一项技术突破。1993年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。二聚合酶链式反应(PCR)聚合酶链式反^(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是种在短吋间内大量扩增特定DNA片段的核酸扩增方法。在介绍PCR之前，我们先简单回顾一下DNA的复制。DNA是由四种碱基按互补配对原则（腺瞟吟A对胸腺嗨喘T,鸟瞟吟G对胞U密旋C）组成的螺旋双链。在细胞内，DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链，每个单链做各自模板，然后,另一种酶一RNA聚合酶合成一小段引物（Primer）结合

4、到DNA模板上，DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链。PCR技术即是在体外模拟DNA复制的过程，由变性一退火（复性）一延伸三个基本步骤构成：假定研究的DNA双链两端的序列是：TATACGGCCTCTAGGCATATATATGCCGGAGATCCGTATA在PCR之前，我们首先人工合成两段有20~30个碱基的引物，能够分别与上下链的一端配对，比如一条是atatg,另一条就是catato把这两段引物和DNA模板、DNA聚合酶、底物（四种脱氧核昔）混合在一起，我们就可以开始PCR了（见图l）o⑴变性：把样品加热到93°C左右

5、一定时间，让DNA模板变性变成单链。（2）退火：让样品的温度下降至55°C左右一段时间，引物就可以结合到模板上去。TATACGGCCTCTAGGCATATatatgcatatATATGCCGGAGATCCGTATA(3)延伸：让样品的温度上升到72°C左右一定时间，DNA聚合酶便可以从引物开始，用底物复制出新链。这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过30个循环，就可以把原来的样品精确地扩增到230倍，只需2-3ho三荧光定量PCR(FQ-PCR)自1989年开始，PC

6、R技术被广泛应用于临床检验。它以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。但十多年的临床实践表明，传统的PCR技术本身还存在着一些问题，如产物污染导致的假阳性、不能准确定量等。为了解决上述问题，经国内外学者的不懈努力,众多PCR相关技术应运而生。其中最引人注目的便是荧光定量FQ-PCR技术。1.原理荧光定量PCR最早是在1992年由日本科学家Higuchi报告提出的。FQ-PCR是指在PCR反应体系屮加入荧光基团，它在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物的变化，荧光信号变量和扩增产物变量成正比，并用足

7、够灵敏的自动化仪器实现对荧光的釆集和分析，最后通过标准曲线对未知模板进行分析，以达到对原始模板量定量的目的。它有几个主要的参数：a.CT值C代表Cycle,T代表Threshold,CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值所经历的循环数。各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用己知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其屮横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数(见图2)。b.荧光域值(Thresh

8、old)的设定将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3^15个循环荧光信号标准差的10倍，即Threshold二10XSDcycle3T5。c.荧光化学FQ-P