荧光定量pcr技术简要

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1、荧光定量PCR的化学原理水解探针的MIXSYBR染料的MIXSYBR染料结合于双链核酸的小沟处与双链DNA结合后受激产生荧光在变性条件下双链分开，荧光消失背景强，非特异性较强SYBR染料法的扩增曲线Taqman探针类水解探针-Rochecobas与ABITaqmanScorpions®AnnealingElongationEndofElongationDenaturationFluoresceinLCRedforsequencespecificdetectionofDNA杂交探针检测－罗氏专利性技术荧光定量PCR仪的光学原理荧光染料的光学性质ABI7500R

2、eal-TimePCRSystems光学原件荧光定量PCR的数据分析标准曲线法2-△△Ct法相对定量标准曲线法LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。优点：无需作标准曲线实用适合于配对样本的相对定量分析2-△△Ct法校正值=2－病人目的基因平均Ct值病人内参基因平均Ct值正常人目的基因平均Ct值正常人内参基因平均Ct值－－－实例举例-BCR/ABL1融合基因定量检测ABL扩增曲线ΔRnBCR/ABL1-P210扩增曲线ΔRn报告举例序号缓解分类缓解指标备注1完全血

3、液学缓解（CHR）血细胞计数正常，白细胞分类计数正常，无髓外白血病表现2主要细胞遗传学缓解（MCyR）Ph阳性细胞=(1~35)%分子学研究已证实不论变异、复杂或遮蔽的Ph易位，CML患者都具有和典型Ph易位相同的分子病理学基础即bcr/abl基因重排,3完全细胞遗传学缓解（CCyR）Ph阳性细胞=0（费城染色体传阴）4主要分子学反应（MMoR）Bcr-abl转录水平下降3个对数级以上;或

4、酸激酶BCR-ABL嵌合蛋白，此蛋白的产生成为此病发病的原因5完全分子学反应（CMoR）Bcr-abl转录水平下降4个对数级以上，RT-PCR检测BCR-ABL为阴性CML缓解指标28mon;23%ofPh+metaphases35mon,CCyR41mon,MMoR细胞遗传+FG分子检测监测CML治疗-举例32mon;23%ofPh+metaphases比较Ct值法-实例Pfafflequation:ifEref=a,Etar=b,so:-Foldchange=b^(ΔCTtarget)/a^(ΔCTref.)THEEND!