细胞CDK2CYCLINA激酶活性荧光共振能量转移法定量检测

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1、细胞CDK2/CYCLINA激酶活性荧光共振能量转移法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细胞CDK2/CYCLINA激酶活性荧光共振能量转移法（FRET）定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针EDANS供体和DABCYL受体双重标记的多肽底物，在CDK2/CYCLINE抑制剂的存在下，受到CDK2/CYCLINA的磷酸化后，不能被位点特异性氨基肽酶切离，而发生荧光峰值的降低，即采用荧光共振能量转移法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中

2、CDK2/CYCLINA激酶的特异活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，安全可靠。技术背景细胞周期素依赖性激酶2（cyclindependentkinase2；CDK2；EC2.7.11.22），又称为细胞分裂周期蛋白1（celldivisioncycle1；CDC1）或p33，属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonineproteinkinase）家属成员之一。其与酵母细胞的cdc28和cdc2高度进化保留。细胞周期素依赖性激酶2的催化亚体，与细胞周期素E然后A结合，允许细胞由G1期进入

3、DNA合成期，达到调节细胞生长、DNA复制、细胞分裂等。p21Cip1（CDKN1A）andp27Kip1（CDKN1B）是CDK2激酶的抑制剂。CDK2/CYCLINA激酶的磷酸化目标序列为HHASPRK。基于磷酸化多肽具有抗氨基肽酶切离的功能，通过荧光共振能量转移法（Fluorescenceresonanceenergytransfer；FRET），即传递激发状态的能量由处于较短波长的供体（donor）到覆盖供体波长的受体（acceptor），使得距离依赖性反应的供体的散发光子淬灭（quench），使用2个荧光探针EDANS供体和DABCYL

4、受体作为FRET对，来标记的CDK2多肽底物的两端，在氨基肽酶（aminopeptidase）的作用下，释放出强烈荧光的EDANS；一旦在CDK2/CYCLINE抑制剂二氨基吡唑-1氢4-基偶氮酚【4-（3,5-diamino-1H-pyrazol-4-ylazo）-phenol】的存在下，底物受到CDK2/CYCLINA的磷酸化（由ATP的γ-磷酸根到多肽上单一丝氨酸残基分子上），底物将不能被位点特异性氨基肽酶切离，而无法释放出EDANS，由此根据产物荧光强度（激发波长340nm，散发波长490nm）的降低，来定量测定细胞周期素依赖性激酶2/细

5、胞周期素A的特异活性。CDK2/CYCLINA反应系统为：CDK2/CYCLINADABCYL-HHASPRK-EDANS+ATP→DABCYL-HHApSPRK-EDANSaminopeptidaseDABCYL-HHApSPRK-EDANS→DABCYL-HHApSPRK-EDANSaminopeptidaseDABCYL-HHASPRK-EDANS→DABCYL-HHA+SPRK-EDANS产品内容清理液（ReagentA）60毫升裂解液（ReagentB）10毫升缓冲液（ReagentC）1.5毫升底物液（ReagentD）50微升5反应

6、液（ReagentE）500微升酶解液（ReagentF）500微升终止液（ReagentG）500微升标准液（ReagentH）10微升磷酸化底物液（ReagentI）50微升（另购）产品说明书1份保存方式保存清理液（ReagentA）和裂解液（ReagentB）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；底物液（ReagentD）和标准液（ReagentH）避免光照，有效保证6月用户自备CDK2/CYCLINA激酶：用于抑制剂筛选磷酸化底物液（ReagentI）：用于测定样品磷酸化程度的反应试剂1.5毫升离心管：用于标准样品操作和样品保存的容器

7、15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离（微型）台式离心机：用于细胞预处理黑色酶标板：用于反应和比色的容器荧光酶标仪：用于荧光分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1．准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5X106细胞）2．小心加入3毫升清理液（ReagentA），覆盖生长表面3．小心抽去清理液4．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）5．加入3毫升清理液（ReagentA），混匀细胞6．移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意

8、：悬浮细胞从这一步骤开始）7．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g8．小心抽去上清液9．加入500微升裂解液（ReagentB）