单分子荧光共振能量转移技术

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1、研究牛光谱技术与应用课程作业河南大学单分子荧光共振能量转移技术学生：郭爱宇学号：104753120870学院：物理与电子学院年级专业：2012级光学工程课程名称：光谱技术及应用指导老师：郭立俊教授单分子荧光共振能量转移技术摘要：单分了荧光共振能址转移技术(singlemoleculefluorescenceresonanceenergytransfer,smFRET)通过检测单个分子内的荧光供体及受体间荧光能量转移的效率，来研究分子构象的变化。在单分子探测技术发展之前，人多数的分子实验是探测分子的综合平均效应(ensembleaverages),这一平均效应掩盖了许多特姝的信息。单分子探测可

2、以対体系中的单个分子进行研究，得到某一分子特性的分布状况，也可研究生物分子的动力学反应。介绍了近来单分子荧光共振能虽转移技术的进展。关键词：单分了；荧光共振能量转移；荧光基团1引言光谱技术是研究生物分子最常用的方法Z—。在单分子光谱(singlemoleculespectroscopy,SMS)探测技术发展以前，人多数的实验是探测分子的综合平均效应，得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分了探测可对体系中的单个分了进行研究，通过与时间相关过程的探测，能实时了解生物大分子构象变化的信息。2002年美国第46届生物物理年会表明单分子仍是

3、生物物理学目前和今后重点发展的研究领域。主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱、与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高吋间分辨率的单分子轨迹追踪等⑴。由此可见，单分子荧光技术具有重要的地位。标记在生物人分子上单个荧光基团的各种特性变化能够提供有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分了运动口由度(molecularfreedomofmotion)及在化学和静电环境下活性改变的信息。近年，在动态结构生物学研究领域，用单分子荧光光谱技术研究生物分子构象变化的方法主要冇两种：一是通过单分子荧光偏振的各向异性(si

4、nglemoleculefluorescencepolarizationanisotropy,smFPA)研究牛物分子的构象动力学(confbnnationaldynamics)和旋转运动(rotationalmotions)。另一个是单分了对荧光共振能量转移(singlepairfluorescenceresonanceenergytransfer,spFRET),在单分了水平测量一个分了内或两个不同分子间的距离变化和相互作用。本文主要就后者做简要介绍。2单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)2.1smFRET原理荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光生色团离的较近，且其中一种生色团(供

5、体，donor)的发射谱与另种生色团(受体，acceptor)的激发谱冇相当程度的重叠吋，当供体被激发时，受体会因供体激发能的转移而被激发。其直观表现就是供体产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体发射的荧光却大大增强，同时伴随它们荧光寿命的相应缩短和延长。能量转移效率与两个生色团激发谱和发射谱的重叠程度、供体与受体跃迁偶极的相对取向、供受体间的距离有密切关系，其经典公式为E=R06/(R6+Ro6)，Ro为能量传递达到50%的距离。选定供、受体对之后，可将Ro看作恒量。能量转移的发生将改变供、受体的去偏振程度、荧光寿命、荧光强度等，测定这些参数值就可得岀E。利用Ro和实验测得的E就可测

6、得供受体间的距离R。用此方法测量生色团距离的方法被称为光谱尺，可测量1.0-10.0nmZ间的距离。smFRET是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上标记两个不同的荧光基I才I。同样，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱相重叠时，发生共振能量转移。通过探测能量转移效率，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分等不确定因索，该方法不能准确确定绝对距离。但口J通过监测供体■受体的相对距离变化，结合其吋间变化推测生物大分子在生命活动小的构象变化。该技术不仅冇非常好的静态定位能力，也能捉供分子内或分子间两个荧光基团在距离和方向上的动态变化。由于每次只观察一对供、受体系统，因此能在毫秒时间尺度内

7、观察这些变化，从而将具有不同能量转移效率的亚群分开。将这种方法扩展,可用于研究生物多聚休的组成动力学、DNA限制性内切酶酶切反应，以及DNA发夹结构的去折叠等27】。2.1smFRET的特点单分了技术的优势使其在生物领域受到极大的青睐。例如在不均一的体系屮，单分子技术能直接反映分子特性的分布状态。此外，在复杂的生物化学反应中，单分子技术能够在不同步化每一步反应的情况下研究每一步的动态化学反应[8,9]O2.2