荧光定量PCR实验检测和指导

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1、荧光定量PCR概述荧光定量PCR的主要概念2什么是荧光定量PCR?2荧光定量PCR工作原理3优化的qPCR实验特点4荧光定量PCR概述1.荧光定量PCR概述核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究。对于某些应用，核酸定性检测就可以满足需求；而另外一些应用，要求进行定量分析。为你的应用选择最好的解决方案需要对技术有广泛的了解。本指南介绍荧光定量PCR的多项技术特点，包括设计优化的荧光定量PCR实验以及不同应用目的的数据处理及分析。第5-7章用不同的实验设计和数

2、据来阐述荧光定量PCR在专业领域的应用，包括基因表达分析、等位基因分析、转基因生物(GMO)检测。本指南介绍了一项强有力的技术及提供了一些必要的信息，希望能满足您现在及将来的应用需求。1.1荧光定量PCR的主要概念1.1.1什么是荧光定量PCR？常规PCR中，扩增产物（扩增子）是通过终点法来分析检测，即PCR反应结束后，DNA通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像分析。而荧光定量PCR可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物

3、质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA拷贝数），即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。2荧光定量PCR

4、概述1.1.2荧光定量PCR工作原理为了更好的了解荧光定量PCR原理，用样品扩增曲线来说明(图1.1)。图中，x-轴表示PCR循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。扩增曲线显示2个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应。此时，产物增长速度变慢，反应进入平台期（图1.1中28-40个循环）。ExponentialphaseNon-0.3exponentialplateauphase0.2Fluorescen

5、ceCvalueT0.1Thresholdline0010203040Cycle图1.1PCR扩增图（显示的是基线扣除后的荧光强度）3荧光定量PCR概述反应最初，虽然产物是指数增长，但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加（图1.1中1-18个循环）。当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即C。由于C值处于指数期内，这时的反应成分不会抑TT制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确地反映反应体系中模板的初始量。C值主要由扩增反应体系中模板的初始浓度决定的。如果模板初始浓度高，只需T要较少的扩增循环就可以累积足够的产物

6、，产生高过背景的荧光信号，因此，反应就有一个小或早出现的C；相反，如果模板初始浓度低，需要较多的扩增循环才能产T生高过背景的荧光信号，反应就有一个大或迟出现的C。两者之间关系的建立是荧光T定量PCR用于定量的依据，将在第4章详细介绍用C值进行定量。T1.1.3优化的qPCR特点由于实时定量建立在模板的初始浓度与C关系的基础上，因此荧光定量PCR的T优化非常重要，保证样本具有准确可重复的实验结果。优化的qPCR结果有以下特点：•线性的标准曲线（R2>0.980或r>

7、–0.990

8、）•高扩增效率（90-105%）•一致的重复反应一种有效的用来确定qPCR实验是否是最优

9、化的方法：将模板稀释成一系列浓度梯度进行PCR反应，用这个结果作标准曲线，模板可以用已知浓度的样品（如纳克级的基因组DNA或多个拷贝的质粒DNA）或未知浓度的样品（如cDNA）。用模板初始量（或未知量样品的稀释倍数）的log值对每个稀释样品的C值作图，两者呈递T减的线性关系，称之为标准曲线。递减的直线关系等式和Pearson相关性系数（r）或可信度（R2）常常被用来判断qPCR条件是否优化。理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，如图1.2A所示。如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数”决定，这里n是阈值线上扩增曲线之间的循