dna依赖蛋白激酶与检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞探究

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1、DNA依赖蛋白激酶与检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞探究　　【摘要】目的：探讨DNA-PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法：通过对DNA-PKshRNA和CHK1shRNA的构建及有效干扰载体的筛选，流式细胞仪检测G2期。结果：转染DNA-PKshRNA的Skov3细胞和Hela细胞经2GyX射线照射后进入G2期的细胞比率无差异；转染CHK1shRNA的Skov3细胞经2GyX射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.618，P=0.026），28h时明

2、显低于Hela细胞（t=2.705，P=0.022）；转染DNA-PKshRNA和CHK1shRNA的Skov3细胞经2GyX射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t=2.965，P=0.014），28h时明显低于Hela细胞（t=2.302，P=0.044）。结论：干扰DNA-PK和CHK1的表达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。【关键词】辐射敏感性；卵巢癌；DNA依赖的蛋白激酶；检查点激酶1卵巢癌（ovarian9cancer）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，死亡率居妇科

3、恶性肿瘤之首。由于卵巢位于盆腔深处，比较隐蔽，使得早期卵巢癌患者缺乏特异的临床症状和有效的检测手段[1，2]，因此，绝大多数患者在明确诊断时肿瘤已经发生转移，严重威胁着妇女的生命健康[3，4]。本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞周期变化及其ATM信号传导途径中DNA依赖的蛋白激酶（DNA-dependentproteinkinase，DNA-PK）和检查点激酶1（checkpointkinase，CHK1）等分子表

4、达的变化，探讨其辐射敏感性差异的机制。1资料与方法1.1主要试剂和仪器pGPU6/GFP/Neo购于上海吉玛制药技术有限公司；BbsⅠ、BamHⅠ、PstⅠ、T4DNAligase、MiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer3.0、MiniBESTPlasmidPurificationKitVer3.0、E.coliCompetentCellsJM109购于日本TaKaRa；Anti-humanDNA-PK、Anti-humanCHK1购于英国Abcom公司；Lip

5、ofectamineTM2000购于Invitrogen。Philip深部X射线治疗机、美国BD公司FACScan流式细胞仪、AnnexinⅤ–FITC细胞凋亡检测试剂盒。1.2方法91.2.1寡核苷酸的设计、合成根据人DNA-PK和CHK1在GenBank登录号HSU34994、AF016582，选择CDS区，应用shRNA设计软件，选择DNA-PK和CHK1干扰RNA的靶点，设计shRNA。在shRNA中的loop结构选择TTCAAGAGA，避免终止信号的形成，转录终止信号选用T6结构。shR

6、NA正义链的5’端添加CACC序列，与BbsⅠ酶切后形成的粘末端互补；反义链的5’端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的粘末端互补。如果siRNA的第一个碱基不是G，则在CACC序列后补加一个G。1.2.2寡核苷酸的退火将合成的DNAoligo用TE（pH8.0）溶解，调整浓度为100μM。取相应的正义链和反义链oligo溶液。配制反应体系：10×shDNAAnnealingBuffer5μl、sensestrand（100μM）5μl、antisensestrand（100μM）5μl、dd

7、H2O35μl、Total50μl。退火条件：95℃5min、85℃5min、75℃5min、70℃5min，4℃保存。退火反应后得到浓度为10μM的双链oligoDNA，将其稀释500倍，使终浓度为20nM。1.2.3载体构建、酶切、鉴定、测序pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体线性化、琼脂糖凝胶回收、双链oligoDNA与线性载体连接、JM109感受态细胞转化、质粒提取。酶切反应体系：重组质粒1μg、10×Buffer2μl、BamHⅠorPstⅠ1μl、ddH2OTo20μl，37℃酶

8、切1h，1%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。选取阳性重组质粒测序（上海英骏生物技术有限公司），应用NCBI上的Aligntwo（ormore）sequencesusingBLAST（bl2seq）软件分析所测得的序列。91.2.4照射条件将细胞以3×105个/孔接种于6孔培养板，照射前用PBS洗细胞2次，加入新鲜的PBS2ml。分别以0、2、4、6、8、10Gy进行照射，照射后立即更换完全培养基。照射条件：电压200kV，电流10mA，滤板0.5mmCu和1.0mmAl，球靶距50c