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《dna依赖的蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、DNA依赖的蛋白激酶和检查点激酶1对卵巢癌细胞周期阻滞的研究【摘要】日的：探讨DNA-PK和CHK1对卵巢癌Skov3的细胞周期阻滞的机制。方法：通过对DNA-PKshRNA和CHK1shRNA的构建及有效干扰载体的筛选，流式细胞仪检测G2期。结果：转染DNA-PKshRNA的Skov3细胞和Heb细胞经2GyX射线照射后进入G2期的细胞比率无差异；转染CHK1shRNA的Skov3细胞经2GyX射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（t二2.618,P二0.026）,28h时明显低于Hela细胞（t二2.705,P二0.022）；转染DNA-PKs
2、hRNA和CHK1shRNA的Skov3细胞经2GyX射线照射后4h进入G2期的细胞比率显著高于Hela细胞（1=2.965,P二0.014）,28h时明显低于Hela细胞（t二2.302,P二0.044）。结论:干扰DNA-PK和CHK1的衣达可增强卵巢癌细胞对辐射的敏感性。【关键词】辐射敏感性；卵巢癌；DNA依赖的蛋白激酶；检查点激酶1卵巢癌（ovariancancer）是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。由于卵巢位于盆腔深处，比较隐蔽，使得早期卵巢癌患者缺乏特异的临床症状和有效的检测手段[1,2],因此，绝人多数患者在明确诊断时肿瘤
3、己经发生转移，严重威胁着妇女的生命健康[3,4]。本研究以shRNA干扰DNA-PK和CHK1在卵巢癌Skov3细胞和宫颈癌Hela细胞中的表达，观察其2Gy照射后细胞周期变化及其ATM信号传导途径中DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependentproteinkinase,DNA-PK)和检查点激酶1(checkpointkinase,CHK1)等分子表达的变化，探讨其辐射敏感性差异的机制。1资料与方法1.1主要试剂和仪器pGPU6/GFP/Neo购于上海吉玛制笏技术有限公司；BbsI、BamllI、PstI、T4DNAligase^MiniBESTAgarose
4、GelDNAExtractionKitVer3.0>MiniBESTPlasmidPurificationKitVer3.0、E.coliCompotentCellsJM109购于日本TaKaRa；Anti-humanDNA-PK、Anti-humanCHK1购于英国Abcom公司；LipofectamineTM2000购于Invitrogen0Philip深部X射线治疗机、美国BD公司FACScan流式细胞仪、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒。1.2方法1.2.1寡核昔酸的设计、合成根据人DNA-PK和CHK1在GenBank登录号HSU34994、A
5、F016582,选择CDS区，应用shRNA设计软件,选择DNA-PK和CIIK1干扰RNA的靶点，设计shRNAo在shRNA中的loop结构选择TTCAAGAGA,避免终止信号的形成，转录终止信号选用T6结构。shRNA正义链的5,端添加CACC序列，与BbsI酶切后形成的粘末端互补；反义链的5’端添加了GATC,与BamHI酶切后形成的粘末端互补。如果siRNA的笫一个碱基不是G,则在CACC序列后补加一个G。1.2.2寡核昔酸的退火将合成的DNAoligo用TE(pIIS.O)溶解，调整浓度为100uMo取相应的正义链和反义链oligo溶液。配制反应体系:1
6、0XshDNAAnnealingBuffer5u1>sensestrand(100uM)5u1>antisensestrand(100uM)5u1>ddH2035卩1、Total50ulo退火条件：95°C5inin、85°C5min>75°C5min>70°C5min,4°C保存。退火反应后得到浓度为10UM的双链oligoDNA,将其稀释500倍，使终浓度为20nMo1.2.3载体构建、酶切、鉴定、测序pGPU6/GFP/Neo-shRNA载体线性化、琼脂糖凝胶回收、双链oligoDNA与线性载体连接、JM109感受态细胞转化、质粒提取。酶切反应体系：重组质粒l
7、ug、10XBuffor2卩1、BamHIorPstI1u1>ddH2OTo20P1,37°C酶切lh,1%琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果。选取阳性重组质粒测序(上海英骏生物技术有限公司),应用NCBI上的Aligntwo(ormore)sequencesusingBLAST(bl2seq)软件分析所测得的序列。1.2.4照射条件将细胞以3X105个/孔接种于6孔培养板，照射前用PBS洗细胞2次，加入新鲜的PBS2mlo分别以0、2、4、6、8、10Gy进行照射，照射后立即更换完全培养基。照射条件：电压200RV,电流10mA,滤板0.5mmCu和1.0mmAl,
