生物化学-质粒DNA测定实验报告.doc

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1、实验名称(TitleofExperimetn)质粒提取、定量与酶切鉴定实验日期(DateofExperiment)2015-11-17实验地点(LabNo.)第四实验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)XX教师签名(Signature)李某某批改日期(Date)2013-06-03【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】1．实验原理1）PCR（PolymeraseC

2、hainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。2）碱裂解法提取质粒：基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；在高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；但当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA能复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。离心层析柱：采用碱裂解法提取质粒，吸附柱内的硅基质质膜在高盐低PH状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其

3、他细菌成分去除，最后低盐，高PH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质上洗脱。3）质粒DNA定量测定-紫外光吸收法因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。而蛋白质的紫外吸收峰在280nm处。通过测定260nm和280nm的吸光度比值（A260/A280），可估计核酸的纯度。A260/A280的比值可以反应DNA的纯度•Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求；•Ratio＞1.9RNA污染；•Ratio＜1.6蛋白质或其它杂质的污染；4）质粒DNA的酶切鉴定限制性核酸内

4、切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶,可分为型。其中，II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列，其识别位点长度为4～6个核苷酸的回文序列。本实验中用到的两种酶类：EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶，可将质粒DNA割成不用大小片段。不同质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位点和数量也不同。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在

5、琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。迁移速率：共价闭环超螺旋DNA＞线性DNA＞开环的双链环状DNA2.实验材料1）样品：含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α2）试剂：LB培养基（液体、固体）质粒提取试剂盒：溶液S1（细菌悬浮液）、裂解液S2、中和液S3、洗涤液W、洗脱液、RNaseA(100mg/ml)、DNA吸附柱HindIII核酸内切酶（TaKaRa）电泳实验上样缓冲液EcoRI核酸内切酶（TaKaRa）10×M酶切缓冲液：蒸馏水3）仪器：恒温培养箱、恒温

6、摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅易瑞质粒小量提取试剂盒、微量移液器（20、100、1000μL）、1.5mL塑料离心管、塑料离心管架（30孔）、紫外检测仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、UVette比色皿等3.实验步骤1）碱裂解法提取质粒2）质粒DNA定量测定95μL蒸馏水紫外分光光度计测定A260/A280调零加5μL质粒ＤＮＡ加样枪调匀测定三组数据3）质粒DNA的酶切鉴定在一个洁净的0.5ml离心管中混匀下列反应物：反应物体积（µl)10×M酶切缓冲液2质粒DNA500~1000ng(10µl)HindIII1EcoRI1H2O至20

7、混合后37℃水浴1～2h琼脂糖凝胶电泳：制备上样：加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀。用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为6µl盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。电泳条件：电压80v；时间25～30分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带。取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果，并拍照记录。4.注意事项1）碱裂解法提取质粒DNA加入250μL裂解液S2不可过分用力振荡，避免染色体DNA因外力作用断裂成小片段，从而与质粒DNA混合在一起，引入误差。2）紫外分光度法测定酶切质粒DNA（1）拿UVette

8、比色皿时，应注意拿着比色皿的粗糙面。最好在使用之前用干净的纸巾擦拭光学面。并且放比色皿时注意将光学面与出光方向一致。空白对