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时间:2020-09-11
《生物化学-质粒DNA测定实验报告.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、实验名称(TitleofExperimetn)质粒提取、定量与酶切鉴定实验日期(DateofExperiment)2015-11-17实验地点(LabNo.)第四实验室合作者(Partner)指导老师(Instructor)总分(TotalScore)XX教师签名(Signature)李某某批改日期(Date)2013-06-03【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】1.实验原理1)PCR(PolymeraseC
2、hainReaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以DNA为模板,特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外复制DNA的过程。2)碱裂解法提取质粒:基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异;在高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA变性;但当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA能复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。离心层析柱:采用碱裂解法提取质粒,吸附柱内的硅基质质膜在高盐低PH状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其
3、他细菌成分去除,最后低盐,高PH的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质上洗脱。3)质粒DNA定量测定-紫外光吸收法因为组成核酸的碱基(G,A,T,C)在260nm处具有强吸收峰,所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。而蛋白质的紫外吸收峰在280nm处。通过测定260nm和280nm的吸光度比值(A260/A280),可估计核酸的纯度。A260/A280的比值可以反应DNA的纯度•Ratio=1.8DNA样品较纯,符合实验要求;•Ratio>1.9RNA污染;•Ratio<1.6蛋白质或其它杂质的污染;4)质粒DNA的酶切鉴定限制性核酸内
4、切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶,是体外剪切基因片段的重要工具酶,可分为型。其中,II型识别和切割的核苷酸序列专一限制性核酸内切酶识别序列,其识别位点长度为4~6个核苷酸的回文序列。本实验中用到的两种酶类:EcoRⅠ和HindⅢ就是II型限制性核酸内切酶,可将质粒DNA割成不用大小片段。不同质粒DNA有不同的核苷酸序列,因而其酶切位点和数量也不同。琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在
5、琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。迁移速率:共价闭环超螺旋DNA>线性DNA>开环的双链环状DNA2.实验材料1)样品:含pMD18-T质粒的大肠杆菌DH5α2)试剂:LB培养基(液体、固体)质粒提取试剂盒:溶液S1(细菌悬浮液)、裂解液S2、中和液S3、洗涤液W、洗脱液、RNaseA(100mg/ml)、DNA吸附柱HindIII核酸内切酶(TaKaRa)电泳实验上样缓冲液EcoRI核酸内切酶(TaKaRa)10×M酶切缓冲液:蒸馏水3)仪器:恒温培养箱、恒温
6、摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅易瑞质粒小量提取试剂盒、微量移液器(20、100、1000μL)、1.5mL塑料离心管、塑料离心管架(30孔)、紫外检测仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、UVette比色皿等3.实验步骤1)碱裂解法提取质粒2)质粒DNA定量测定95μL蒸馏水紫外分光光度计测定A260/A280调零加5μL质粒DNA加样枪调匀测定三组数据3)质粒DNA的酶切鉴定在一个洁净的0.5ml离心管中混匀下列反应物:反应物体积(µl)10×M酶切缓冲液2质粒DNA500~1000ng(10µl)HindIII1EcoRI1H2O至20
7、混合后37℃水浴1~2h琼脂糖凝胶电泳:制备上样:加样前,样品先与6×上样缓冲液混匀。用加样器吸取样品,轻轻的加入到凝胶的样品孔中,加样量为6µl盖上电泳槽,接通电源,开始电泳。电泳条件:电压80v;时间25~30分钟;电泳结束后,切断电源,取出凝胶。电泳结果分析:紫外检测仪直接观察电泳条带。取出凝胶,置于凝胶成像仪中观察结果,并拍照记录。4.注意事项1)碱裂解法提取质粒DNA加入250μL裂解液S2不可过分用力振荡,避免染色体DNA因外力作用断裂成小片段,从而与质粒DNA混合在一起,引入误差。2)紫外分光度法测定酶切质粒DNA(1)拿UVette
8、比色皿时,应注意拿着比色皿的粗糙面。最好在使用之前用干净的纸巾擦拭光学面。并且放比色皿时注意将光学面与出光方向一致。空白对
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