质粒dna测定实验报告

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1、生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定实验日期2014-12-11实验地点第4实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法2.掌握碱裂解法提取质粒的方法3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理（一）、第一部分聚合酶链式反应1.PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过

2、程。1)加热使模板DNA，在高温下90℃-95变性，双链解链；2)降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链；3)溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。（二）、第二部分质粒DNA提取与定量1.质粒（Plasmid）1)独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；1)存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。2.碱裂解法、1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；2)高碱性条件下，

3、染色体DNA和质粒DNA变性；3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。3.离心层析柱1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸附蛋白质、多糖等物质；2)通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；3)低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。4.紫外光吸收法1)物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；2)而且物质对光的吸收是具有选择性的；3)各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。4)因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度

4、的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。（三）、第三部分酶切鉴定1.限制性内切酶1)限制性内切酶（restrictionendonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本工具；2)特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA；1)分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。（四）、第四部分琼脂糖凝胶电泳1.天然琼脂1)天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成；2)琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的

5、中性物质，不带电荷；3)琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。2.基本原理1)琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度；2)DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；3)DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。

6、三、材料与方法：（一）实验材料1.试剂1)菌液：大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD19-T)2)引物：正向：5’GTA　AAA　CGA　CGG　CCA　GT3’反向:5’CAG　GAA　ACA　GCT　ATG　AC3’1)2×PremixTaq：Taq酶：5U/μl4×dNTP:各10mmol/L10×缓冲液（buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTris-HCl2)灭菌去离子水3)含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α4)LB培养基（液体、固体）5)AXYGEN试剂盒质粒提取试剂盒（爱思进，中国）a)溶液P1（S1)b)溶液P2(S2）c)溶

7、液P3（S3）d)去蛋白液PE（W1)e)漂洗液WB(W2）f)洗脱液EB（Eluent)6)DNAMarker7)电泳缓冲液1.仪器与器材1)PCR仪(BioRadMJmini)2)台式离心机3)微量加样枪4)灭菌的薄壁离心管5)凝胶电泳系统6)凝胶成像系统7)恒温培养箱8)恒温摇床1)超净工作台2)台式离心机3)高压灭菌锅（二）方法与步骤部分方法步骤注意事项1)1.注意每换一种试剂换一个新吸头)2.如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离