质粒DNA抽提实验报告.doc

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1、质粒DNA抽提实验报告一．实验目的：1.掌握碱裂解法小量快速提取质粒DNA的方法，提取的质粒DNA可直接用于酶切，PCR扩增等。2.学习利用水平式琼脂糖凝脉电泳初步检测DNA的纯度，构型，含量和分子量大小。二．实验原理：碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN结果A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，

2、而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三．实验仪器及试剂：1.5mlEP管、高速离心机、移液枪溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HCl（pH8.0）2毫克/毫升溶菌酶溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS溶液III：3mol/LNaAc（pH4.8）溶液、TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、pH7.51mmol/LEDTA四．实验步骤:1、取1.5ml细胞培养物于1.5mlEP管中，12000rpm/

3、min离心1min，去上清液（重复一次）2、加200μl溶液Ⅰ重悬浮细胞3、加200μl溶液Ⅱ，轻轻摇匀，放置5min4、加150μl溶液，轻轻摇匀，冰浴5min，12000rpm/min离心5min5、取上清，加入等体积氯仿，摇匀，12000rpm/min离心10min6、去上清，加入等体积异丙醇，室温放置5min，12000rpm/min离心10min7、70%乙醇洗涤沉淀2次，风干8、加20ddH2O溶解沉淀，-20℃下保存备用五．实验结果：得到大肠杆菌质粒DNAPCR以及电泳实验报告一．实验原理：PCR：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下

4、，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。电泳：琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1%的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据

5、蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。二．实验仪器及试剂：EP管、离心机、PCR仪、电泳槽、电泳仪、移液枪、紫外透射检测仪等DNA模板、与特定DNA模板结合的引物、去离子水、商业化的DNA聚合酶以及缓冲液、dNTP、DNA荧光染料溴化乙锭、琼脂糖凝胶三．PCR反应体系（25μl）2×PCRmix12.5μl引物11μl引物21μl20ddH2O10.5μl四．操作步骤1、94

6、℃预变性5min，然后94℃，30s-64℃，45s-72℃，1min循环7次2、94℃，30s-55℃，45s-72℃，1min循环23次3、72℃，10s4、电泳检测五．实验结果分析分离不同大小的DNA片段所用的最适凝胶浓度是不同的，数据见下表：如右图所示：实验所用的琼脂糖凝胶浓度为1.3%，实验的DNA条带位置在500bp-750bp之间，接近500bp，证明实验是成功的对照组实验组750bp500bp1000bp2000bp100bp250bp