乐脉丸微生物限度检查验证方案.doc

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1、乐脉丸微生物限度检查法方法学验证资料【处方】丹参998g川芎499g赤芍499g红花499g香附249.5g木香249.5g山楂124.8g【制法】以上七味，加水煎煮三次，每次1小时，加水量分别为10、8、8倍，合并煎液，滤过，滤液低温（45～50℃）浓缩至相对密度为1.10～1.30（50℃）的清膏，在80℃以下干燥，粉碎，加入适量淀粉，用90%乙醇和大豆油制软材，挤压一滚圆制丸，干燥，制成1000g，即得。【用法用量】口服，一次1～2袋，一日3次。【微生物限度检查】细菌计数按规定取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，充分分散均匀，即为1：10供试液

2、。取1：10的供试液1ml各注2个皿，（每皿1ml），其它操作按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法平皿法计数。霉菌、酵母菌计数按规定取本品10g，加入pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法使充分分散均匀，即为1：10供试液，1：10供试液1ml各注2个皿（每皿1ml），其它操作按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法平皿法计数。控制菌检查大肠埃希菌，检查按中国药典2005年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法规定的相应方法检查。一、验证目的：验证乐脉丸在所设定的检验条件及程序下检验，对其中可能存在的细菌数、霉菌、酵母菌数及控制菌是否无

3、抑制作用；以确定适宜的检验方法。二、验证范围：金鸡丸、、三个批次三、验证条件：1、培养基：营养琼脂、虎红琼脂、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基等。以上培养基均已按规定方法灭菌。2、稀释剂：PH为7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（经121℃灭菌30分钟）3、仪器：天平、35～37℃的生化培养箱、30～35℃恒温培养箱(、23～28℃生化培养箱、温度计、高压灭菌器、经121℃30分钟灭菌的玻璃仪器、数显水浴恒温振荡器、医药净化工作台4、菌种：按以下方法制备成已知浓度的菌液。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉

4、4.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35℃培养24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－5～10－7，使细菌数约为150～200cfu/ml。4.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养24小时，取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－5～10－7，使菌数约为150～200cfu/ml。4.3接种黑曲霉的新鲜培养物至新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，25℃培养7天，加5～10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出

5、孢子悬液，取1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10－4～10－6，使孢子数约为150～200cfu/ml。四、验证方法（一）细菌总数、霉菌、酵母菌总数采用平皿计数法的验证。对三批乐脉丸分别进行三次独立的平行试验。并分别计算各试验菌的回收率。1、供试品对照组取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，制成浓度为1：10供试液。用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，按照10倍递增稀释法，制备连续2个稀释级的供试液。每一稀释度吸1ml供试液入平皿中，并注两皿作平行样，分别在每平皿中注入约15ml温度不超过45℃的营养琼脂或虎红琼脂、

6、混匀、凝固、倒置培养。（营养琼脂板于30～35℃培养箱中培养48小时；虎红琼脂板于23～28℃生化培养箱中培养72小时），测定供试品的本底菌数。2、试验组取1：10供试液1ml和1ml各试验菌液，分别加入平皿中，立即倾注营养琼脂或虎红琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，置培养箱中培养后测定其菌数。（用大肠埃希、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌液注皿的用不超过45℃的营养琼脂注皿，置30～35℃培养箱中培养48小时后测定其菌数；用白色念珠菌、黑曲霉菌液注皿的用不超过45℃的虎红琼脂注皿，置23～28℃培养箱中培养72小时后测定其菌数）3、菌液组不加供试液，直接取上述各菌液的量，分别

7、依上法用琼脂培养基注皿，培养后计数，测定所加的试验菌数。4、合格标准若试验各组的菌回收率均不低于70%，该品种平皿计数法测定细菌、霉菌及酵母菌数通过验证；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。注：试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数试验组的菌回收率=-------------------------------------------------×1