微生物限度检查验证方案.doc

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1、微生物限度检查验证方案　　起草人起草日期年月日验证小组成员会签日期：年月日批准人批准日期年月日目录1.适用范围2.验证目的3.职责4.验证所需材料及仪器4.1.验证所需仪器4.2.验证所需材料5.可接受的限度范围标准6.实验方法6.1.细菌、霉菌及酵母菌验证6.2.控制菌验证7.验证评审及报告8.再验证周期9.附件1.适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。2.验证目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。3.职责姓名部门职责1.验证所需材料及仪器1.1验证所需仪器SKP-01电热恒温培养箱、DHP-360S电热恒温培养箱、

2、YXQ.SG41.280A手提式压力蒸汽灭菌器、SW-CJ-1F净化工作台、培养皿。1.2验证所需材料大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。大肠埃细菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉菌为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。验证实验所用的菌株穿戴次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试

3、验菌株的生物学特性。2.可接受的限度范围标准2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。2.2控制菌验证若试验组检出试验菌（检出试验菌判断如下），按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。5.2.1大肠埃细菌检查结果判断如MU

4、G阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯培养基的平板上，培养18～24h。琼脂判供试品检出大肠埃希菌；若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗

5、色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润3.实验方法3.1细菌、霉菌及酵母菌验证6.1.1菌液制备接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠

6、溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml。6.1.2供试液制备取供试品10g，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液。6.1.3验证方法6.1.3.1菌液组：测定所加的试验菌数，采用平皿法。取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿，立即倾入培养基。每株试验平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。6.1.3.2试验组：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿，立即倾入培养基，平行制备2个平皿。6.1.3.3供试品对照

7、组：取供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数（方法和试验组相同）6.1.3.4回收率计算试验组的菌回收率=试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数6.2控制菌验证菌液组平均菌落6.2.1菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，使细菌数约为10～100cfu/ml。6.2.2供试液的制备取供试品10g，pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液。6.2.3验证

8、方法6.2.3.1试验组大肠埃希菌分别