乐脉丸微生物限度检查验证方案

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1、乐脉丸微生物限度检查法方法学验证资料【处方】丹参998g川茸499g赤芍499g红花499g香附249.5g木香249.5g山楂124.8g【制法】以上七味，加水煎煮三次，每次1小时，加水量分别为10、8、8倍，合并煎液，滤过，滤液低温（45〜50°C）浓缩至相对密度为1.10〜1.30（50°C）的清膏，在80°C以下干燥，粉碎，加入适量淀粉，用90%乙醇和大豆油制软材,挤压一滚圆制丸,干燥，制成1000g,即得。【用法用量】口服，一次1〜2袋，一日3次。【微生物限度检查】细菌计数按规定取本品10g,加入pH7.0无菌氯化钠一蛋口月东缓冲液至100ml,充分分散均匀

2、,即为1：10供试液。取1：10的供试液lml各注2个血，（每皿lml）,-Jt：它操作按屮国药典2005年版一部附录XIIIC微生物限度检查法平皿法计数。按规定取本品10g,加入PH7.0无菌氯化钠一蛋白月东缓冲液至100ml,用适宜的方法使充分分散均匀，即为1：10供试液，1：10供试液lml各注2个皿（每皿Iml）,其它操作按中国药典2005年版一部附录XIIIC微牛物限度检查法平皿法计数。控制菌检查大肠埃希菌，检查按屮国药典2005年版一部附录XIIIC微生物限度检查法规定的相应方法检查。一、验证目的：验证乐脉丸在所设定的检验条件及程序下检验，对其中可能存在的

3、细菌数、霉菌、酵母菌数及控制菌是否无抑制作用；以确定适宜的检验方法。二、验证范围：金鸡丸2009030U20090302.20090303三个批次三、验证条件：1、培养基：营养琼脂、虎红琼脂、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、改良马丁培养基，改良马丁琼脂培养基等。以上培养基均已按规定方法灭菌。2、稀释剂：PH为7.0无菌氯化钠■蛋白月东缓冲液（经121°C灭菌30分钟）3、仪器：天平、35〜37°C的生化培养箱、30〜35°C恒温培养箱（、23〜28°C生化培养箱、温度计、高压灭菌器、经121oC30分钟灭菌的玻璃仪器、数显水浴恒温振荡器、医纱净化工

4、作台4、菌种：按以下方法制备成已知浓度的菌液。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、口色念珠菌、黑曲霉4.1接种人肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，35°C培养24小时，取此培养液lml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至ICT'〜10-7,使细菌数约为150〜200cfu/mlo4.2接种白色念珠菌的新鳞培养物至改良马丁培养基中，25°C培养24小时，取此培养液lml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至10乍〜10一7,使菌数约为150〜200cfu/mlo4.3接种黑曲霉的新鲜

5、培养物至新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，25°C培养7天，加5〜10ml0.9%无菌氯化钠溶液，将抱子洗脱，然后吸出抱子悬液，取lml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至10一4〜IO",使抱了数约为150〜200cfu/mlo四、验证方法（一）细菌总数、霉菌、酵母菌总数采用平皿计数法的验证。对三批乐脉丸分别进行三次独立的平行试验。并分别计算各试验菌的冋收率。1、供试品对照组取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠一蛋白Jj东缓冲液至100ml,制成浓度为1：10供试液。用PII7.0无菌氯化钠一蛋口腺缓冲液，按照10倍递增稀释法，制备连续

6、2个稀释级的供试液。每一稀释度吸51供试液入平皿中，并注两皿作平行样，分别在每平皿屮注入约15ml温度不超过45°C的营养琼脂或虎红琼脂、混匀、凝固、倒置培养。（营养琼脂板于30〜35°C培养箱中培养48小时；虎红琼脂板于23〜28°C生化培养箱中培养72小时），测定供试品的本底菌数。2、试验组取1：10供试液lml和lml各试验菌液，分别加入平皿中，立即倾注营养琼脂或虎红琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平1111,置培养箱中培养后测定其菌数。(用大肠埃希、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌液注皿的用不超过45°C的营养琼脂注皿，置30〜35°C培养箱屮培养48小吋后测定

7、其菌数；用白色念珠菌、黑曲霉菌液注皿的用不超过45°C的虎红琼脂注皿，置23〜28°C培养箱中培养72小时后测定其菌数)3、菌液组不加供试液，直接取上述各菌液的量，分别依上法用琼脂培养基注皿，培养后计数,测定所加的试验菌数。4、合格标准若试验各组的菌回收率均不低于70%,该品种平皿计数法测定细菌、霉菌及酵母菌数通过验证；若任一次试验屮试验组的菌冋收率低于70%,应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。注：试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数试验组的菌回收率二x10