加味烂积丸微生物限度检查方法验证的研究

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1、加味烂积丸微生物限度检查方法验证的研究成都九芝堂金鼎药业有限公司王红涛加味烂积丸收载于《部颁标准》中药成方制剂第二册89页，由大黄、牵牛子(炒)、陈皮、木香、川木香、21味屮药组成，具消积化滞之功效。为保证用药安全冇效，确保沉香理气丸的抑菌活性及测定方法的可靠性，在此对本品细菌、霉菌及酵母菌数计数方法及人肠埃希菌的检杳方法进行了验证，以确认所采用的方法适合于该药品细菌、霉菌及酵母菌数的测定及人肠埃希菌的检杳。具体方法如下：试验依据：《屮国药典》2005版一部微生物限度检杏法方法验证试验细菌、霉菌及酵母菌数测定的方法验证一.菌液制备1.取经37°C培养18-24

2、小时，人肠埃希菌、金黄色匍萄球菌、枯草芽砲杆菌营养肉汤培养物lnil加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液10倍稀释至100103为so、］。。个加，做活菌计数备用。2.取经25°C培养24-48小吋的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液10倍稀释至lO^lOY为50、100个/ml,做活菌计数备用。3.取经25°C培养1周的黑

3、11

4、霉菌斜面培养物，加3ml0.9%的无菌氯化钠溶液洗卜•霉菌他子，吸菌液51加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液,逐管10倍稀释为10^105约50100个/ml,做活菌计数备用。二.供试液制备称取加味烂积丸样

5、品10g,加PH7.0无菌氯化钠-蛋白腺缓冲液至100ml,作为1：10的供试液。三•验证方法验证试验应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。1)试验组：取供试液各lml^1150lOOcfu/ml±述五种试验菌株，分别注入平皿小，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，置规定温度培养24、72小吋观察结果，按平皿法测定其菌数。2)菌液组：测定每一菌株加的试验菌数。3)供试品对照组：测定供试品本底菌数。药品微生物限度检查方法验证试验记录检品名称加味烂积丸批号060001检验目的微生物限度检査方法验证检验日期2006年11

6、月2日检验依据《中国药典》2005版一部报告日期2006年11月13日方法：阳性菌液制备：采用10倍稀样法。枯草芽也杆菌［CMCC(B)63501］稀禅至106金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］稀释至106A色念珠菌［CMCC(F)98001］稀释至106黑曲霉［CMCC(F)98003］稀释至105大肠埃希菌［CMCC(B)44102］稀释至1(T回收率计算：回收率二(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组的平均菌落数X100%菌落计数结果表以下数据均为平行制备2个平1111的平均菌落数。试验次数：第一次大肠埃希菌10-7金黄色筍萄球菌

7、10'6枯草芽他杆菌10"6白色念珠菌10"黑曲霉10~5试验组138157132159132菌液组6776517760供试品对照组8383838383回收率％82.197.496.19&781.7试验次数：第二次大肠埃希菌107金黄色衙萄球菌106枯草芽他杆菌10°白色念珠菌10°黑曲霉105试验组140142134141131菌液组7180696556供试品对照组7878787878回收率％87.380.081.296.994.6试验次数：第三次大肠埃希菌10-7金黄色葡萄球菌10'6枯草芽抱杆菌10-6白色念珠菌10"黑曲霉10-5试验组13913213

8、5134127菌液组6268667153供试品对照组8181818181回收率％93.582.381.874.686.8大肠埃希菌检查的方法验证试验方法：1.试验组:取1：10的加味烂积丸供试液10ml及10lOOcfu大肠埃希菌菌株加入胆盐乳糖培养基中;1.阴性对照组：取1：10的加味烂积丸供试液10ml及10lOOcfu金黄色葡萄球菌菌株加入胆盐乳糖培养基中；取以上两种样品按照人肠埃希菌检查法进行检查，试验结果见下表:大肠埃希菌验证试验结果表检验步骤胆盐乳糖培养基MUG试验靛基质结论试验组+++检出大肠埃希菌阴性对照组———未检出结果判断:试验结果显示：在

9、3次独立的平行试验小，加味烂积丸对枯草芽抱菌、金黄色葡萄球菌、口色念珠杆菌、黑曲霉、人肠埃希菌冋收率均超过70%,符合要求，故进行细菌及霉菌、酵母菌数计数时可采用常规法测定；对于人肠埃希菌的检杳，采用金黄色匍萄球菌为阴性对照，试验组生长正常，阴性对照组未能检出人肠埃希菌，故本品人肠埃希菌检杳亦可按常规法检验。因此，加味烂积丸微牛物限度检查供试品液的制备可采用常规方法。