龙胆泻肝丸微生物限度检查方法验证论文

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1、龙胆泻肝丸微生物限度检查方法验证论文【摘要】目的：建立一种龙胆泻肝丸微生物限度检查方法。方法：采用药典规定的常规法和稀释法，通过验证确认所采用的方法是否适合于*该药品的细菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。结果：细菌、霉菌和酵母菌方法验证中回收率在70%以上;控制菌方法验证中阳性对照菌检出，阴性对照菌未检出。结论：龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌、霉菌和酵母菌数可以采用常规法或稀释法进行检查，控制菌检查可以采用常规法检查。【关键词】微生物限度;验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及

2、酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。1实验材料1.1培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁液体培养基、改良马丁琼脂培养基、MUG培养基、靛基质试液。1.2菌种大肠埃希菌CMCC(B)44102、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。1.3供试品龙胆泻肝丸。2菌液的制备2.1大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢

3、杆菌的营养琼脂斜面培养物接种于10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法.freell含菌数50～100cfu的菌悬液。2.2白色念珠菌菌液制备取白色念珠菌的改良马丁琼脂斜面培养物接种于10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时;取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6或10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的菌悬液。2.3黑曲霉菌液制备取黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加

4、入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液,.freell加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。3供试液的制备取供试品10g，加pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪混匀，作为1:10供试液。4回收率测定4.1细菌回收率测定4.1.1试验组(1)常规法：取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别同时注入于平皿中，做10个平皿;立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。(2)稀释法：取1:10

5、供试液1ml等量分注入于5个平皿中，每个平皿加试验菌(10-6约50～100cfu)1ml，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。4.1.2菌液组取上述试验菌液，测定每一菌株所加的试验菌菌数。采取平皿法，取试验用的菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别注入平皿中，立刻倾注培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。4.1.3供试品对照组(1)常规法：取1:10供试液1ml注入于平皿中，做2个平皿;立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃温度培养48小时，逐日观察结果。(2)稀释法：取1:

6、10供试液1ml等量分注于5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置30～35℃培养48小时，逐日观察结果。4.2霉菌、酵母菌回收率测定4.2.1试验组取1:10供试液1ml、菌液(10-6约50～100cfu)1ml，分别同时注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置23～28℃培养72小时，逐日观察结果。4.2.2菌液组同4.1.2。4.2.3供试品对照组取1:10供试液1ml注入于平皿中，立即倾注玫瑰红钠培养基，待凝固后，置规定温度培养72小时，逐日观察结果。4.3细菌、霉菌和酵母菌计数及验证结果表1细菌、霉菌和酵母菌计数及方法验证

7、的试验以上数据为3次试验结果(注：稀释法中枯草芽孢杆菌回收率不易达到70%)。5控制菌方法的验证取2瓶100ml胆盐乳糖培养基，分别加入1:10供试液各10ml，其中1瓶加入大肠埃希菌液1ml,另1瓶加入金黄色葡萄菌液1ml，置35～37℃培养24小时，分别取上述培养液0.2ml接种于5mlMUG培养基中，培养于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。试验重复3次(表2)。表2控制菌检查方法验证试验结果6讨论由表1结果看出，细菌、霉菌和酵母菌试验组的回收率在70%以上，说明龙胆泻肝丸微生物限度检查法的细菌数和霉菌

8、、酵母菌数可以采用常规法和稀释法两种方法中的任一种进行测定。由表2