安乃近微生物限度检查方法的验证

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1、安乃近片微生物限度检查方法验证报告1目的确认安乃近片的抑菌活性及测定方法的可靠性。2内容细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。3方法按中国药典2010版微生物限度检查方法验证的要求进行方法验证。4菌种4.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证所用菌种：大肠埃希菌〔CMCC(F)44102〕（10-7）、金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕（10-6）、枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕（10-5）、白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕（10-5）、黑曲霉菌〔CMCC(F)98003〕（10-4）。4.2控制菌检查方法的验证所用菌种：大肠埃希菌〔CMCC(F)

2、44102〕。5培养基、稀释剂营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂斜面培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、胆盐乳糖培养基、MUG培养基、乳糖胆盐发酵培养基。6方法验证6.1验证要求细菌、霉菌及酵母菌数测定，至少进行3次独立的平行试验，每次平行试验回收率均应在70%以上:若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。控制菌检查方法的验证要求试验组检出试验菌—大肠埃希菌。6.

3、2验证过程6.2.1细菌、霉菌及酵母菌数测定方法的验证6.2.1.1菌液制备a、取经30—35℃培养18—24小时的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、培养物1ml，分别加9ml无菌0.9%氯化钠溶液10倍稀释为10-7、10-6、10-5约50—100cfu/ml，做活菌计数备用。b、取经23—28℃培养24—48小时的白色念珠菌液体培养物1ml加9ml无菌0.9%-4-氯化钠溶液10倍稀释为10-5约50—100cfu/ml，做活菌计数备用。c、取经23—28℃培养5—7天的黑曲霉斜面培养物，加3—5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠

4、溶液洗下霉菌孢子，然后吸取出孢子悬液（用无菌纱布过滤菌丝）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释为10-4约50—100cfu/ml，做活菌计数备用。6.2.1.2供试液制备称取安乃近片10g，加pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液100ml。培养基稀释法：采用加0.2ml/皿供试液。6.2.1.3回收率测定a、菌液组①取10大-7肠埃希菌稀释液各1ml,注入两个平皿中；取10-6金黄色葡萄球菌稀释液各1ml,注入两个平皿中；取10-5枯草芽孢杆菌稀释液各1ml,注入两个平皿中，倾注营养琼脂培养基各约15ml-20ml，置30℃

5、—35℃培养3天，测定其菌数。②取10-5白色念珠菌稀释液各1ml,注入两个平皿中；取10-4黑曲霉稀释液各1ml,注入两个平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基各约15ml-20ml，置23℃—28℃培养5天，测定其菌数。b、供试品对照组①取供试液各1ml,按0.2ml/皿分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基各约15ml-20ml，置30℃—35℃培养3天，测定其菌数。②取供试液各1ml，按0.2ml/皿分别注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基各约15ml-20ml，置23℃—28℃培养5天，测定其菌数。c、试验组①取供试液各1ml，按0.2ml/皿和10-7大肠埃希菌稀释液各1m

6、l，分别注入平皿中；取供试液各1ml，按0.2ml/皿和10-6金黄色葡萄球菌稀释液各1ml，分别注入平皿中；取供试液各1ml按0.2ml/皿和10-5枯草芽孢杆菌稀释液各1ml，分别注入平皿中；倾注营养琼脂培养基各约15ml-20ml，置30℃—35℃培养3天，测定其菌数。②取供试液各1ml，按0.2ml/皿和10-5白色念珠菌稀释液各1ml,分别注入平皿中；取供试液各1ml，按0.2ml/皿和10-4黑曲霉稀释液各1ml,分别注入平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基各约15ml-20ml，置23℃—28℃培养5天，测定其菌数。d、阴性对照试验①取pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲

7、液各1ml,注入两个平皿中，倾注营养琼脂培养基各约15ml-20ml，置30℃—35℃培养3天，测定其菌数。-4-②取pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液各1ml，注入两个平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基各约15ml-20ml，置23℃—28℃培养5天，测定其菌数。6.2.2控制菌检查方法的验证6.2.2.1大肠埃希菌a、试验组取供试液10ml及10—100cfu大肠埃希菌1ml加入胆盐乳糖培养基中，置35℃培养24小时后，取培养物0.2ml至含5mlMUG培养基的试管内培养，于5小时24小时在366nm紫外光下观察，应能检出大肠埃希