高效液相色谱法简介ppt课件.ppt

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1、高效液相色谱法High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC主要内容第一节概述第二节高效液相色谱仪第三节高效液相色谱类型第四节固定相和流动相的选择第五节图形结果分析及其应用第一节概述高效液相色谱（HPLC）也叫高压液相色谱（highpressureliquidchromatography）、高速液相色谱（highspeedliquidchromatography）、高分离度液相色谱（highresolutionliquidchromatography）等。高效液相色谱法是以

2、液体作为流动相的色谱法，它是利用样品中各组分在色谱柱中固定相和流动相相间分配系数或吸附系数的差异，将各组分分离后进行定性、定量分析。发展历史20世纪初，俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。1960年代末，科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。20世纪70年代，高效液相

3、色谱法开始广泛应用。高效液相色谱的特点高压——压力可达150～300kg/cm2。色谱柱每米降压为75kg/cm2以上。高速——流速为0.1～10.0mL/min。高效——塔板数可达5000/米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。第二节高效液相色谱仪高效液相色谱仪基本装置流动相进样阀注入样品液色谱柱检测器色谱处理机高压泵流出液高效液相色谱仪的组成高效液相色谱仪一般可分为四个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：

4、如梯度淋洗，自动进样、馏分收集及数据处理等。1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很小约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去（气泡会影响检测）。1、高压输液系统3）高压泵注射型泵------输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。◆恒流泵往复型泵------造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。高压泵按排液性质可分为：恒压型和恒流型。对流量变化敏感的检测器会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器。◆恒

5、压泵--------压力恒定，但流量不恒定（现在已经较少使用）。（使用较多）输液泵应具备如下性能：①流量稳定②流量范围宽③输出压力高，一般应能达到150～300kg/cm2；④液缸容积小；⑤密封性能好，耐腐蚀。输液泵操作注意事项：防止固体微粒进入泵体流动相不应含有腐蚀性物质防止溶剂瓶内的流动相被用完不超过规定的最高压力流动相一般应该先脱气HPLC有等强度(isocratic)和梯度(gradient)洗脱两种方式。等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。梯度洗脱是

6、在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。4）梯度淋洗装置：梯度洗脱有两种实现方式：一是高压梯度（内梯度），利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合均匀后再进入色谱柱。二是低压梯度（外梯度），通过比例调节阀，将两种不同极性的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合，随后打入色谱柱。高压梯度低压梯度2、进样系统

7、早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。现在大都使用六通进样阀或自动进样器。进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。HPLC进样方式可分为：（1）隔膜进样（2）停流进样（3）自动进样（4）阀进样（1）隔膜进样。使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差，常规分析使用受到局限。（2）停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现“鬼峰”；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色

8、谱中，效果较好。（3）自动进样。用于大量样品的常规分析。（4）阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀，其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降5~10%左右），但耐高压（35~40MPa），进样量准确，重复性好（0.5%），操作方便。图六通进样阀分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（