基因工程第二章 DNA重组的克隆操作ppt课件.ppt

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1、2DNA重组的单元操作基因工程载体必需具备的4个基本条件具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率。具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。具有多种单一限制性内切酶位点。具有合适的选择标记基因。2.1DNA重组的载体2.1.1质粒载体一、质粒的一般生物学特性（一）质粒DNA的分子特性1、自主复制性已知的绝大多数质粒都是双链闭合环状DNA分子。除了酵母的杀伤质粒是一种RNA分子外，其他已知的所有质粒无一例外地都是DNA分子。质粒DNA分子的三种构型闭合环状DNA（ccDNA

2、），即SC构型开环DNA（ocDNA），即OC构型线形DNA（lDNA），即L构型2、可扩增性3、质粒的不相容性严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有1～3个松驰型质粒：其拷贝数较多，一般20～60个，多的可达200～300个。质粒的不亲和性（也称为不相容性）：是指在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能在同一个宿主细胞中稳定共存的现象。在细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐稀释、排斥掉，这样的两种质粒称为不亲和质粒。4、质粒的转移性结合型质粒（conjugativeplasmid）又叫自

3、我转移型质粒，其分子量一般都比较大，除携带自主复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。非接合型质粒(nonconjugativeplasmid)又叫不能自我转移型质粒，其分子质量较小，虽然携带自主复制所必需的遗传信息，但不携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞自我转移到另一个细胞中。质粒的迁移作用：如果在非转移型质粒的宿主细胞中存在一种相容的接合型质粒，那么它也会被自我转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质

4、粒的转移，叫做质粒的迁移作用。二、理想质粒载体的必备条件（一）天然质粒用做载体的局限性1.pSC101大小：9.09kb严谨性质粒具有多个限制酶的单一切点（二）理想质粒载体的必备条件1、具有较小的分子量和较高的拷贝数。2、具有若干限制性内切酶的单一酶切位点。3、具有两种以上的选择标记基因。4、缺失mob基因。5、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。三、质粒载体的构建（一）pBR322质粒载体的构建1、组成来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复

5、制起点ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr。2特点具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr中有BamHI切点（G↓GATCC）和SalⅠ切点（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切点（CTGCA↓G）。利用ColEl的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。具有较小的分子量。3重组克隆的“插入失活”筛选方法pBR322—→插入在Tetr中，基因型为Tets、Ampr——→在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在在含有四环素培养基上不生长；pBR322—→插入

6、在Ampr中，基因型为Tetr、Amps、——→在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可不生长；而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。AmprTetrTetrAmpsPstI........涂布有Tet的培养基涂布有Amp的培养基......重组体的筛选外源基因的插入：.四、常用的质粒载体（一）克隆质粒载体具有更小的分子量（2686bp）具有多克隆位点1、pBR322质粒及其派生质粒2、pUC系列质粒载

7、体具有更高的拷贝数。可用组化方法筛选重组体，更方便、更省时。可用组化方法鉴别：含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因（LacZ′），它编码β-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，即α-互补，恢复分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β-半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到pUC质粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌

8、中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大肠杆菌完整的β-半乳糖苷酶（二）表达质粒载体表达载体应含有：（1）强启动子（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。表达载体可分为非分泌型表达载体分泌型表达载体原核细胞表达载体真核细胞表达载体或例：pBV221（1）利用λ噬菌体的PL、PR作为串联启动子。一个温度敏感的转