重组DNA技术与基因工程ppt课件.ppt

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1、第二十三章DNA重组与基因工程DNA重组技术是指将不同的DNA片段(如基因等)按人们的设计方案定向地连接起来，并在特定的体细胞中，与载体一起得到复制与表达，使受体细胞获得新的遗传特性。从某种意义上来说，DNA重组技术也可理解为基因工程分子克隆基因工程遗传工程一.基本概念二.基因工程的基本程序：三.DNA重组技术（基因工程）的应用DNA重组的最大特点：打破了种属的界限，实现了不同种属生物的基因交流利用DNA重组技术大量生产一些在正常细胞代谢中产量很低的多肽物质。如多肽激素、多肽抗生素、酶类、抗体及各种其他多肽类物质。定向

2、地改造生物基因组结构，使它某些具有经济价值的功能得以百倍地提高。将DNA重组技术应用于基础研究。如在基因组结构的研究中，在基因组功能调节的研究中都离不开这项技术。DNA重组技术（基因工程）的应用工具酶及其应用基因工程的载体目的基因的分离与测序目的基因与载体的连接基因转化（转基因）目的基因的鉴定与表达本章的主要内容：第一节　工具酶一.限制性核酸内切酶核酸酶核酸外切酶：从核酸的一端开始，一个一个的水解核苷酸核酸内切酶：从核酸链中间水解3′,5′－磷酸二酯键，将核酸链切断限制性核酸内切酶：能识别特定的核酸序列而将核酸切断2.

3、限制性核酸内切酶的作用大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5′磷酸基和3′羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，有的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。几种最常用的限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶名称识别序列和切割点BamHⅠClaⅠEcoRⅠHindⅢKpnⅠNotⅠPstⅠSalⅠSau3AⅠSfiⅠSmaⅠXbaⅠXhoⅠG↓GATCCAT↓CGATG↓AATTCA↓AGCTTGGTAC↓CGC↓GGCCGCCTGCA↓GG↓TCGAC↓GATCGG

4、CCNNNN↓NGGCCCCC↓GGGT↓CTAGAC↓TCGAG①产生3’突出粘性末端（cohesiveend）:以EooR为例：5’…G↓AATTC…3’→5’…Gp  OHTTAAC…3’3’…CATAA↑G…5’EooPⅠ3'…   CTTAAOH  pG…5'②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ3’…GOH pACGTC…5③产生平末端（bluntend）:NruⅠ为例：5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCG

5、pOHCGA…3’3’…AGC↑GCT…5’NruⅠ3’…AGCOHpGCT…5’3.限制性内切酶酶切的结果二.DNA重组中其它工具酶从噬菌体T4感染过的大肠杆菌中分离。此酶由一条肽链组成，分子量6800；催化DNA上的3′－OH与5′－P末端之间的磷酸二酯键的形成。既可催化粘性末端间的也可催化平头末端间的连接。需ATP，Mg2＋1.T4DNA连接酶由一条肽链构成，分子量10900，具有三种活力：（1）5′3′聚合酶活力，以单链DNA为模板，引物　需带有3′－OH，合成DNA；2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ3.反转录酶酶主

6、要用途限制性核酸内切酶识别DNA特定序列，切断DNA链DNA聚合酶Ⅰ①缺口平移制作标记DNA探针或其大片段（Klenow）②合成cDNA的第二链③填补双链DNA3’凹端④DNA序列分析耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶等）聚合酶链反应（PCR）DNA连接酶连接两个DNA分子或片段多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针末端转移酶在3’末端加入同质多聚物尾SI核酸酶，绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端DNA端酶Ⅰ降解DNA，在双链DNA上产生随机切口RNA酶A降解除RNA磷

7、酸酶切除核酸末端磷酸基4.DNA重组中工具酶的主要用途第二节　基因工程载体1.理想的基因工程载体的要求：①能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。②容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。③容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。④容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。⑤有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才便于克隆操作。一.质粒质粒（plasmid

8、）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分一般由双链共价闭合环形DNA构成。根据染色体对质粒的控制程度或拷贝数可以分为两类：1.严紧型控制（stringentcontrol）质粒：复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1个到十几个拷贝；2.松弛型控制（relaxedcontrol）质粒，其复制