《DNA重组技术》PPT课件

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1、第六章重组DNA技术的操作ADNA的体外重组（切、接）B用于基因转移的受体菌或细胞C重组DNA分子的转化和扩增（转、增）D转化子的筛选和鉴定（检）第六章重组DNA技术的操作过程切接转增检一DNA的体外重组（切与接）第六章重组DNA技术的操作过程同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接粘性末端的更换人工粘性末端的连接重组率外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶和DNA连接酶的作用。一般说来在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：(1)实验步骤要尽可能地简单易行，(2)连接形成的“接点

2、”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段，(3)对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。F重组率重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。F重组率提高重组率的方法提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAApAATTCG5'p5'GCTTAAOH5'5'AATTCG5'HO退火5'G-A-A

3、-T-T-CC-T-T-A-AG5'GA-A-T-T-CC-T-T-A-A-GOHHOOHHO碱性磷酸单酯酶碱性磷酸单酯酶二用于基因转移的受体菌或细胞各种基因工程受体的特性实验室常用的基因工程受体受体细胞应具备的条件一、宿主的选择从安全性考试，应具备以下条件：1.不适合在人体内生存2.不适合在非培养条件下生存3.在非培养条件下，其DNA容易解体4.它的DNA不易转移5.它的质粒只在这一宿主由复制6.便于检测A受体细胞应具备的条件从遗传性考虑：1.重组缺陷型recA－，用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-）2.限制系统的缺陷，或是修饰系统的缺陷。避免对外源DNA的除解。外切酶和内切酶

4、活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）3.与重组质粒的遗传性状要有显的差异（具有与载体选择标记互补的表型）4.具有较高的转化效率A受体细胞应具备的条件B各种基因工程受体的特性大肠杆菌遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌产物结构复杂、种类繁多的内毒素B各种基因工程受体的特性枯草杆菌遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌遗传欠稳定，载体受体系统欠完备B各种基因工程受体的特性

5、链霉菌抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素主要用于抗生素生产菌株的改良遗传不稳定，生长相对缓慢B各种基因工程受体的特性酵母菌具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌内源性蛋白产物种类繁多且含量高B各种基因工程受体的特性昆虫细胞（家蚕）具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定适用于真核生物基因的高效表达DNA重组操作系统欠完善B各种基因工程受体的特性哺乳动物

6、细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体细胞培养条件苛刻，生长缓慢B各种基因工程受体的特性植物细胞（拟南芥菜、烟叶）农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良遗传操作繁琐C实验室常用的基因工程受体大肠杆菌用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、JM101（Aps、Tcs、Cms）用于接受l-DNA：LE392、ED8

7、654酵母菌哺乳动物细胞CHO毕赤酵母啤酒酵母三重组DNA分子的转化和扩增（转与增）转化的原理与技术转化率转化细胞的扩增A转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态A转化的原理与技术Ca2+诱导的完整细菌细