重组DNA技术和基因工程.ppt

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1、重组DNA技术与基因工程523416重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母中的表达3重组DNA技术的操作过程切接转增检ADNA的体外重组（切与接）同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接基于同源重组的体外In-Fusion连接重组率3重组DNA技术的操作过程基于CRISPR-Cas9系统的体内切接同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GC

2、TTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGAT

3、CCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstI3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CT

4、AGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接5’突出末端5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'5'5'AATTCGT4-DNAligase5'5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCC

5、CAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火BamHIBamHIEcoRIBamHICTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseTdTTdTdCTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火PstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCC

6、CGTACG5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowPstISphI人工粘性末端的连接3’突出末端人工粘性末端的连接平头末端C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-DNAligaseTdTTdTdTTPdATPGTTTTTT

7、TTTT3'C退火C3'TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA3'GG3'AAAAAAAAAAC5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1C3'5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT基于同源重组的体外In-Fusion连接载体质粒重组质粒每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的15个碱基序列引物引物In-Fusi