重组DNA(基因工程)的技术路线

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1、重组DNA（基因工程）的技术路线摘要：重组DNA技术是指将一种牛物体的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。关键词：路线；方法；“基因工程的技术路线，一般包括四步：第一步是产生DNA片段；第二步是DNA片段和载体DNA分子相连接；第三步是将重组DNA分子导入宿主细胞；第四步是选出含有所需要的重组DNA分子的宿主细胞。⑴”1重组DNA片段的取得1.1利用限制酶取得具有黏性末端或平末端的DNA片段1.2机械法剪切取得具有平整末端的DNA片段，如用超声波断裂双链DNA分子1.3经反向转录酶的作用，

2、从RNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNAo1.4用化学方法合成DNA片断。从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，依照这个密码用化学方法人工合成基因。2DNA片段和载体的连接2.1黏性末端连接“当载体和外源DNA用同一种限制性内切核昔酸消化时，可产生相同黏性末端。当带有相同黏性末端的DNA片段在一起消火，在DNA连接酶的催化作用下黏性末端的单链之间便可以进行碱基配对，被共价的连接起来形成重组DNA分子。⑵”2.2平整末端连接某些限制性内切酶作用的结果产生不含黏性末端的平整末端，用机械剪切方法取得的DNA片段也是平整；在某些连接酶的作用下，同样

3、可以把两个这样的DNA片段连接起来。2.3同聚末端连接。“在脱氧核昔酸转移酶的作用下可以在DNA片段的3■耗基端合成低聚多核廿酸；如果把所需要的DNA片段接上低聚腺卩票吟核廿酸，而把载体分子接上低聚糖卩密喘核昔酸，那么由于两者之间能形成互补氢键，同样可以通过DNA连接酶的作用而完成DNA的载体间的连接。⑶”2.4人工接头分子连接。“在两个平整末端DNA片段的一段接上用人工合成的寡聚核昔酸接头片段，其中包含有某一限制酶的识别位点；经这一限制酶处理便可以得到具有黏性末端的两个DNA片段，进一步就可以用DNA连接酶，把这两个DNA分子连接起来。⑷”3导入宿主细胞“带有外源DNA片段

4、的重组体分子在体外形成后，需要导入适当的寄主细胞进行繁殖，才能获得大量纯一的重组体DNA分子。⑸”3.1转化转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。3.2转染“外源DNA片段与噬菌体DNA载体连接后组成重组的噬菌体DNA,包装噬菌体外壳蛋白后，组装成有感染力的噬菌体颗粒，将这些重组的噬菌体颗粒按一定比例与宿主细胞混合培养，利用噬菌体的主动感染，将含有外源DNA片段的重组噬菌体DNA注入宿主菌体内，依照噬菌体的生活周期，重组噬菌体DNA就在宿主细胞中复制增殖。⑹”3.3转导“重组噬菌体DNA被包装到噬菌体头部成为

5、有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导。⑺”4选择连接起来的DNA中，既可能包括需要的DNA片段，有可能包括不需要的DNA片段，所以选择也是很重要的。4.1遗传学方法“对于带有抗药性基因的质粒，从被转化细菌是否由敏感状态变为抗药的状态，就可以知道它有没有获得这一抗药性质粒。⑻”4.2免疫学方法“免疫沉淀检测法是在培养基中添加特异性的抗体，如果有菌落分泌出对应的抗原蛋白，抗原•抗体结合形成的沉淀会在菌落周围形成白色圆圈。这种方法主要用于检测分泌蛋白。⑼”5基因表达能使外来的基因在宿主细胞中能准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在

6、宿主细胞中不被分解，最好还能分泌到细胞外。5」基因表达的方法一在形成垂组DNA分子吋，在载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。5.2基因表达的方法二“将外源的基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产牛一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯，要准确地将两部分分开，才能获得所需要的蛋白质。［，01v参考文献：［1］基因工程概论/舒慧国著.一北京：中国人事出版社，2005.1（国家公务员自然科学丛书）［2］基因工程/何水林主编，仪治本，余丽芸副主编.■…北京：科学出版社，2008［3］生物化学（第三版）/王镜岩，朱圣庚，徐长法.■…北京：高

7、等教育岀版社，2003⑷基因工程技术/曾佑伟，揭广川，李家洲编.…北京：屮国轻工业出版社，2010.7［5］基因工程技术/冯斌，谢先芝编箸北京：化学工业出版社，2000.11［6］基因工程原理与方法/孙树汉主编，张平武，戴建新副主编，-…北京：人民军医出版社,2001.7⑺基因工程/杨汝德主编，■…广州：华南理工大学出版社，2003.8.⑻基因工程/邓云，万永奇,李东屏.■…北京：化学工业出版社，2010.9［9］基因工程/孙明主编，陈雯莉，程新耀等.■…北京：高等教育出版社，2006.5［10］生物信