基因工程第二章DNA重组技术.ppt

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1、第二章DNA重组技术2021/8/21主要内容DNA的结构天然DNA的制备限制性核酸内切酶对DNA的切割.PCR扩增特定DNA片段凝胶电泳检测DNADNA片段的连接重组2021/8/22第一节DNA的结构一、DNA组成Nucleicacidispolynucleotide,NucleotidesarethebuildingblocksofNucleicAcidDNA.首尾2021/8/23Pentosefive-carbonsugar2-Deoxyribose2｀－脱氧核糖1、核苷酸Phosphate、pentos

2、e、base(碱基)Hydroxylgroup羟基Hydrogen氢2021/8/24Thymine胸腺嘧啶TCytosine胞嘧啶CGuanine鸟嘌呤GAdenine腺嘌呤AFourBasesinDNAPyrimidines嘧啶Purines嘌呤2021/8/25H2O碱基五碳糖核苷键核苷6022021/8/26H2OH2ObasePhosphatePentose核苷键Phosphateesterbond核苷酸NucleotideGlycosidicbond2021/8/278种核苷酸M-单(D-二。T－三）；

3、P-磷酸RNA的名称为某（单、二、三）苷酸，DNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。如AMP称腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP称为脱氧腺苷—磷酸（脱氧腺苷酸）。稀有核苷酸与上类似；腺嘌呤A鸟嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNAAMPGMPCMPUMP未发现DNAdAMPdGMPdCMP未发现dTMP2021/8/282、DNADNA中核苷酸通过3’,5’-磷酸二脂键连接2021/8/29headtail脱H2O脂键相连3`5`3`，5`-磷酸二酯键3’,5’-phosphodiesterbond2021/8/210

4、二、DNAstructure2021/8/2111、B型DNA双螺旋MostDNAhavedoublehelixstructure(1).两条链反向、平行、右手螺旋有大沟和小沟5`3`5`3`2021/8/212(2).磷酸、戊糖在外侧，碱基在内，链间碱基形成氢键。2021/8/213（3）.两碱基对间距0.34nm,螺距3.4nm.2021/8/214经常用碱基对数来表示DNA长度(4).碱基互补配对原则：A=TC=G2021/8/2152、DNA序列在DNA中，两链间的碱基是互补的知道其中一条链的序列后，另一链

5、也可推测出来。因此DNA序列一般只用其中一链序列由5`向3`书写5`TCTC3`3`AGAG5`5`TCTC3`2021/8/2163、DNA变性DNA变性：DNA双链打开变异无规则的单链的过程。粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加.变性因素：加热,改变溶液pH、加有机试剂2021/8/217。计算公式：（G+C)%=(Tm-63.0)×2.44解链温度（Tm）使50%DNA变性的温度.经常在70-85C间，随G/C含量的升高而升高.2021/8/2184、DNA复性变性因素去除后，变性DNA又恢复成双

6、螺旋结构的过程。温度下降过快，DNA不能复性。变性复性2021/8/2195分子杂交具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链过程叫核酸分子杂交只要有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。2021/8/220DNA与DNA间的杂交全部互补时部分互补时变性复性2021/8/221DNA与RNA间的杂交全部互补时部分互补时变性复性2021/8/2226DNA的形状线性DNA：真核生物的染色体ＤＮＡ部分原核生物染色体ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．2021/8/223环状ＤＮＡ真核生物线粒体ＤＮ

7、Ａ叶绿体ＤＮＡ部分原核生物染色体ＤＮＡ质粒ＤＮＡ部分病毒ＤＮＡ．2021/8/224chloroplastmitochondriaThecircularDNAcanbesupercoiled环状DNA以超螺旋形式存在环状DNA2021/8/225。2021/8/226负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，旋转结果使DNA分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状DNA呈负超螺旋结构。正超螺旋：与负超螺旋相反，形成超螺旋时的旋转方向与DNA双螺旋方向相同，结果加大了DNA分子内部张力，

8、有紧旋效应。2021/8/2277DNA的复制半保留复制（原核、真核）Semiconservationreplication2021/8/228亲代DNA分子第一子代分子亲代DNA分子第一子代分子2021/8/229DNA复制过程复制起始位点双链打开引物酶合成RNA引物，DNA聚合酶延长引物.前导链连续延伸,滞后链通过冈奇片段以不连续方式延伸。在新合成的DN