DNA重组克隆的单元操作

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1、第2章DNA重组克隆的单元操作DNA重组的载体；DNA的体外重组；重组DNA分子的转化与扩增；转化子的筛选与重组子的鉴定；目的基因的克隆。2.1用于基因克隆的载体质粒（plasmid）噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征载体的功能及特征1.载体的功能①为外源基因提供进入受体细胞的转移能力②为外源基因提供复制能力或整合能力③为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.载体应具备的条件①具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性。③具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。④具有合适的筛选标记。②具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。质粒1.质粒的基本特征质粒是生物

2、细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的质粒是DNA型的。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构。质粒DNA的分子量范围：1-100kb。质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制引物与模板的结合oriE.coliColE1plasmid复制方向rop（+）RopRNAIIRNAI3’5’5’3’质粒质粒的基本特征质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制–质粒DNA复制启动控制控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep可扩增性根

3、据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒1-5拷贝stringentplasmid松弛型复制控制的质粒30-50拷贝Relaxedplasmid质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：①接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）。②非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。质粒的不相容性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F拥有相似的复制子结构，彼此不相容携带

4、特殊的遗传标记物质抗性：抗生素、重金属离子、紫外线、X射线物质合成：细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。2.质粒的改造与构建野生型质粒分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多由pSC101、ColE1和pSF2124构建。①删除非必需区域DNA。②灭活某些质粒的编码基因。如mob基因，负调控基因③加入标记基因。④添加MCS，删除重复酶切位点。⑤加上一些调控序列。3.质粒的分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒扩增基因低拷贝质粒表达某些毒性基因测序质粒用于测序整合质粒外源基因的整合穿梭质粒基因

5、克隆表达质粒表达外源基因探针质粒启动子等元件的克隆筛选4.重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制pBR322：氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆pUC18/19：拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal蓝色pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特

6、异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3ZPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶。如E.coliBL21（DE3）等。①碱溶法i.用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁iii.加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物iv.加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质v.离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质vi.乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNAvii.用无DNase的RNase去除残余的RNAcccDNAL-DNAocDNA5.质粒DNA的分离纯化②沸水浴法

7、i.用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体ii.加溶菌酶裂解细菌细胞壁iii.沸水浴40秒钟iv.离心，用无菌牙签挑去沉淀物v.乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA噬菌体噬菌体是一类特异性的病毒，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。1.大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体的生物学特性l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长